臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)本的采集與合理使用抗生素

合格的微生物培養(yǎng)標(biāo)本

與抗生素的合理使用

主要內(nèi)容一、開展微生物檢驗(yàn)的必要性二、臨床微生物室的任務(wù)三、與臨床溝通中常見問題四、臨床微生物標(biāo)本的采集及運(yùn)送原則一、開展微生物檢驗(yàn)的必要性

為進(jìn)一步促進(jìn)抗菌藥物合理使用，有效控制細(xì)菌耐藥，保證醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)療安全，《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》（衛(wèi)生部令第84號）已于2012年2月13日經(jīng)衛(wèi)生部部務(wù)會審議通過，現(xiàn)予以發(fā)布，自2012年8月1日起施行。范圍：全國各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)，重點(diǎn)是二級以上公立醫(yī)院。二級以上醫(yī)院應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際需要，建立符合實(shí)驗(yàn)室生物安全要求的臨床微生物室?！掇k法》建立抗菌藥物臨床應(yīng)用分級管理制度。根據(jù)安全性、療效、細(xì)菌耐藥性、價(jià)格等因素，將抗菌藥物分為三級：非限制使用級、限制使用級與特殊使用級。具體劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：（一）非限制使用級抗菌藥物是指經(jīng)長期臨床應(yīng)用證明安全、有效，對細(xì)菌耐藥性影響較小，價(jià)格相對較低的抗菌藥物；

適用于輕度、局部感染（醫(yī)師）如：青霉素、氨芐西林、阿莫西林、甲硝唑等（二）限制使用級抗菌藥物是指經(jīng)長期臨床應(yīng)用證明安全、有效，對細(xì)菌耐藥性影響較大，或者價(jià)格相對較高的抗菌藥物；

適用于嚴(yán)重感染、合并感染（主治）如：三代頭孢、頭孢哌酮/他唑巴坦、阿奇霉素、替硝唑（三）特殊使用級抗菌藥物是指具有以下情形之一的抗菌藥物：

1.具有明顯或者嚴(yán)重不良反應(yīng)，不宜隨意使用的抗菌藥物；

2.需要嚴(yán)格控制使用，避免細(xì)菌過快產(chǎn)生耐藥的抗菌藥物；

3.療效、安全性方面的臨床資料較少的抗菌藥物；

4.價(jià)格昂貴的抗菌藥物。

適用于病情危重會診確認(rèn)（主任）四代頭孢、甘酰胺類（替加環(huán)素）、碳青霉烯類、糖肽類、惡唑酮類、卡泊分凈、莫西沙星等

二、臨床微生物室的任務(wù)

1.開展微生物培養(yǎng)、分離、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)等工作，提供病原學(xué)診斷和細(xì)菌耐藥技術(shù)支持，參與抗菌藥物臨床應(yīng)用管理工作。藥物敏感試驗(yàn)定義：使用體外試驗(yàn)的方法檢測細(xì)菌的耐藥性，預(yù)測抗菌藥物的臨床治療效果，并為臨床醫(yī)生針對某一特定的臨床感染問題選用藥物提供依據(jù)----實(shí)施個(gè)體化治療。

我院微生物室VITEK2-Compact全自動細(xì)菌鑒定儀BacTALERT3D全自動血培養(yǎng)儀CO2孵箱普通孵箱干燥箱染色槽標(biāo)本傳遞倉、掃描條碼接收標(biāo)本2.醫(yī)療機(jī)構(gòu)要根據(jù)臨床微生物標(biāo)本藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物:接受限制使用級抗菌藥物治療的住院患者抗菌藥物使用前微生物檢驗(yàn)樣本送檢率不低于50%；接受特殊使用級抗菌藥物治療的住院患者抗菌藥物使用前微生物送檢率不低于80%。

3.開展細(xì)菌耐藥監(jiān)測工作，定期發(fā)布細(xì)菌耐藥信息，建立細(xì)菌耐藥預(yù)警機(jī)制，針對不同的細(xì)菌耐藥水平采取相應(yīng)應(yīng)對措施；醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照要求向全國抗菌藥物臨床應(yīng)用監(jiān)測網(wǎng)報(bào)送抗菌藥物臨床應(yīng)用相關(guān)數(shù)據(jù)信息，向全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報(bào)送耐藥菌分布和耐藥情況等相關(guān)信息。（1）主要目標(biāo)細(xì)菌耐藥率超過30%的抗菌藥物，應(yīng)當(dāng)及時(shí)將預(yù)警信息通報(bào)本機(jī)構(gòu)醫(yī)務(wù)人員；（2）主要目標(biāo)細(xì)菌耐藥率超過40%的抗菌藥物，應(yīng)當(dāng)慎重經(jīng)驗(yàn)用藥；（3）主要目標(biāo)細(xì)菌耐藥率超過50%的抗菌藥物，應(yīng)當(dāng)參照藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用；（4）主要目標(biāo)細(xì)菌耐藥率超過75%的抗菌藥物，應(yīng)當(dāng)暫停針對此目標(biāo)細(xì)菌的臨床應(yīng)用，根據(jù)追蹤細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果，再決定是否恢復(fù)臨床應(yīng)用。

金黃色葡萄球菌（905株）對抗菌藥物的敏感性(%)

大腸埃希菌（2634株）對抗菌藥物的敏感性(%)

大腸埃希菌（2634株）對抗菌藥物的敏感性(%)

鮑曼不動桿菌（854株）對抗菌藥物的敏感性(%)

嗜麥芽窄食單胞菌（227株）對抗菌藥物的敏感性(%)三、與臨床溝通中常見問題1.我們想用的藥物在藥敏試驗(yàn)中沒有做？藥敏試驗(yàn)是參照美國的CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)制定的。細(xì)菌全自動分析儀的藥敏組合是固定的。某些細(xì)菌對某類抗生素天然耐藥，則不需要做藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)的藥物代表一類藥，而不是一種藥。藥物的敏感性可被其他藥物所預(yù)報(bào)。2.為什么有的菌藥敏報(bào)告很多種藥物，有的僅報(bào)告幾種藥物？藥敏試驗(yàn)是參照美國的CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)制定的,我國也按照此標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。報(bào)告的藥物種類根據(jù)細(xì)菌種類的不同而有所不同，如銅綠假單胞菌報(bào)告的藥物較多，而嗜麥芽窄食單胞菌報(bào)告的藥敏較少。CLSI藥敏建議3.是否能將所用的藥都做藥敏試驗(yàn)?沒有必要：通過耐藥機(jī)制和標(biāo)志性藥物可以預(yù)測其他抗菌藥物的敏感性沒有可能：不是所用藥物都可以做藥敏試驗(yàn)（需要藥物在體外穩(wěn)定，需要有操作標(biāo)準(zhǔn)和解釋標(biāo)準(zhǔn)）4.培養(yǎng)陽性的患者都需要用抗菌藥物治療嗎？不是的培養(yǎng)陽性感染，可能為污染（血培養(yǎng)），也可能為定植（痰培養(yǎng)）任何結(jié)果必須結(jié)合臨床情況進(jìn)行評價(jià)（很重要）感染部位的清創(chuàng)、引流、換藥比使用抗菌藥物更加重要改善患者全身情況：器官功能支持，糾正酸堿平衡，電解質(zhì)紊亂，低蛋白血癥，高血糖等5.取的明顯就是膿液標(biāo)本，為何鑒定報(bào)告為無菌生長？因?yàn)榭赡苣撝行牡募?xì)菌被大量的中性粒細(xì)胞吞噬，已經(jīng)死亡。我們盡量取化膿組織與正常組織交界處膿汁，交界處活菌較多，可提高檢出率。我們做的是有氧培養(yǎng)，膿液可能為厭氧菌感染。6.選擇藥敏報(bào)告敏感的藥物，為什么臨床治療無效？體外藥敏試驗(yàn)只能預(yù)測體內(nèi)治療效果，并不等同；一般來說，耐藥＝治療無效；敏感≠治療有效。可能不是真正的致病菌（污染或定植菌）細(xì)菌本身因素（如誘導(dǎo)耐藥，生物被膜）感染部位與藥代動力學(xué)因素細(xì)菌的MIC，給藥劑量和用藥方式藥敏試驗(yàn)藥物中有些藥物單獨(dú)使用無效，但可以與其他藥物聯(lián)合用藥藥物劑型及生物利用度（純品、商品）7.涂片鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果不吻合？涂片鏡檢是報(bào)告所有檢見的細(xì)菌，而培養(yǎng)的目的是檢出致病菌。一些苛氧菌需在特殊的環(huán)境或培養(yǎng)基上才能生長。尿道分泌物細(xì)胞內(nèi)外吞噬8.今天的培養(yǎng)結(jié)果怎么與前天的不一樣？取材是否規(guī)范。痰標(biāo)本，有時(shí)選優(yōu)勢菌做，就可能導(dǎo)致兩次不一樣。9.明顯稀便，培養(yǎng)結(jié)果為何正常？大便普通培養(yǎng)，通常只能鑒定志賀菌、沙門菌感染。懷疑霍亂時(shí)，需開霍亂弧菌培養(yǎng)?？赡懿《靖腥?輪狀病毒、腸道病毒)。四、臨床微生物標(biāo)本的采集及運(yùn)送（一）規(guī)范采集及運(yùn)送標(biāo)本的重要性

我們應(yīng)該追求：

“準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷”

“針對性病原學(xué)治療”

“有效預(yù)防醫(yī)院感染”

正確的微生物標(biāo)本采集和運(yùn)送，是準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷的前提！

微生物讓人類步步為營，

檢驗(yàn)誤差發(fā)生率哪個(gè)階段最高？

研究表明，60%以上實(shí)驗(yàn)誤差發(fā)生在分析前，這也是檢驗(yàn)質(zhì)量管理中最難控制的部分。因此，獲得準(zhǔn)確結(jié)果的重要環(huán)節(jié)

分析前質(zhì)量控制不合格標(biāo)本帶來的后果標(biāo)本不合格結(jié)果不準(zhǔn)確診斷錯誤治療錯誤（二）微生物標(biāo)本采集原則及時(shí)采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本采樣時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作采樣后立即送檢甚至床旁接種尤其是厭氧培養(yǎng)棉拭子標(biāo)本要保持濕潤，宜用運(yùn)送培養(yǎng)基標(biāo)本容器須滅菌處理，但不得使用消毒劑。送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗(yàn)?zāi)康淖钣袃r(jià)值的細(xì)菌學(xué)檢測項(xiàng)目

血液培養(yǎng)腦脊液培養(yǎng)膽汁培養(yǎng)胸腹水培養(yǎng)關(guān)節(jié)液其他無菌體液或分泌液

標(biāo)本的采集和選擇的基本要求1.選擇準(zhǔn)確的解剖部位、合適的時(shí)間、適當(dāng)?shù)脑O(shè)備采集標(biāo)本；2.采集足夠量的標(biāo)本，以保證檢測的陽性率；

標(biāo)本運(yùn)送的基本要求1.所有常規(guī)性細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)本需在采集后2h內(nèi)送至微生物室，若延遲送檢，應(yīng)放于安全防護(hù)盒內(nèi)；腦脊液應(yīng)在15分鐘內(nèi)送到；2.尿液標(biāo)本置于2-4℃冰箱保存不能超過24h；3.疑似苛養(yǎng)菌感染的標(biāo)本立即保溫送檢。（三）各類臨床微生物標(biāo)本的采集

1.血培養(yǎng)標(biāo)本的采集血培養(yǎng)是進(jìn)行血流感診斷的最佳手段“只有在發(fā)熱時(shí)，才需要進(jìn)行血培養(yǎng)?！薄P(guān)于血培養(yǎng)指征想采就采？血培養(yǎng)的指征臨床上疑為敗血癥、膿毒血癥或其他血液感染的患者有：不明原因的發(fā)熱(≥

38℃)或體溫過低(≤

36℃)白細(xì)胞增多（＞

10×109/L，特別有“核左移”未成熟的或桿狀核白細(xì)胞增多）粒細(xì)胞減少（＜成熟的多核白細(xì)胞<1×109/L

）休克，寒顫，多器官衰竭嚴(yán)重的局部感染(腦膜炎，心內(nèi)膜炎，肺炎，腎盂腎炎，腹部術(shù)后感染，…)，CRP升高

采集血培養(yǎng)樣本的最佳時(shí)間盡可能在患者寒戰(zhàn)或開始發(fā)熱時(shí)采血在患者接受抗生素治療前采血如患者已經(jīng)應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行治療，應(yīng)在下一次用藥之前采血培養(yǎng)

血培養(yǎng)檢測消毒程序

1.皮膚消毒程序：嚴(yán)格執(zhí)行三步法（防止皮膚寄生菌污染）

（1）用75%酒精擦拭靜脈穿刺部位待30s以上；

（2）然后用1%-2%碘酊作用30秒或10%碘伏作用60秒，從穿刺點(diǎn)向外畫圈消毒，至消毒區(qū)域直徑達(dá)3cm以上；（3）最后用75%酒精脫碘，待酒精揮發(fā)干燥后采血。

新生兒及對碘過敏的患者，只能用75%酒精消毒60s，待穿刺部位酒精揮發(fā)干燥后穿刺采血。

2.培養(yǎng)瓶消毒程序：

（1）用75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞，作用60秒。

（2）用無菌紗布或無菌棉簽清除橡皮塞表面剩余的酒精，然后注入血液。

關(guān)于采集血液量采血量是影響檢出陽性率最關(guān)鍵因素成人一份標(biāo)本2個(gè)培養(yǎng)瓶（需氧＋厭氧），每瓶8－10ml，共20ml；要求至少采兩份標(biāo)本，即40ml。兒童一般只需采集需氧瓶，在保證采集血量＜1％總血量下，一般為1－3ml。采血量不足時(shí)應(yīng)優(yōu)先保證需氧瓶，因臨床90％以上的感染為需氧菌或兼性需氧菌感染。

2.下呼吸道（痰培養(yǎng)）標(biāo)本采集

病原體種類繁多而復(fù)雜

使下呼吸道感染病原診斷成為難題細(xì)菌（包括放線菌與奴卡菌，厭氧菌與分枝桿菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原體、衣原體與立克次體原蟲寄生蟲咳痰途經(jīng)口咽部唾液中口咽部定植菌的濃度可達(dá)108-109/ml。研究顯示，國內(nèi)常規(guī)痰標(biāo)本中約半數(shù)存在唾液嚴(yán)重污染現(xiàn)象。不可避免地受到污染

采集指征凡是發(fā)熱、咳嗽和咳痰，痰呈膿性、粘稠或血性，并伴有胸痛、氣急，肺部聞及濕羅音，外周白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例明顯增高，X線檢查提示肺部有炎性浸潤或胸腔積液，甚至出現(xiàn)感染性休克和呼吸衰竭等患者，應(yīng)采集痰液或下呼吸道標(biāo)本。對可疑烈性呼吸道傳染?。ㄈ鏢ARS、肺炭疽、肺鼠疫等）患者采集檢驗(yàn)標(biāo)本時(shí)必須注意生物安全防護(hù)。

我國痰培養(yǎng)現(xiàn)狀標(biāo)本送檢率低苛養(yǎng)菌檢出率極低結(jié)果重復(fù)性差報(bào)告速度慢感染菌與污染菌不易區(qū)分藥敏結(jié)果與治療反應(yīng)存在差距標(biāo)本采集方法

（1）自然咳痰法

以晨痰為佳。用清水反復(fù)漱口，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入無菌容器中，盡快送檢。否則有的細(xì)菌（如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌）在外界可能死亡。（2）小兒取痰法用彎壓舌板向后壓舌，用棉拭子深入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時(shí)，可噴出肺部和氣管分泌物，粘在棉拭子上送檢。幼兒還可用手指輕叩胸骨柄上方，以誘發(fā)咳痰。（3）支氣管鏡采集法-經(jīng)支氣管鏡直接吸引

-支氣管肺泡灌洗

-防污染樣本毛刷醫(yī)師或護(hù)士直視下采集標(biāo)本病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液臨床上約半數(shù)咳痰標(biāo)本不合格！合格標(biāo)本的判斷標(biāo)準(zhǔn)外觀：觀察顏色、粘度、有無血絲或膿。若標(biāo)本為水狀且很明顯是唾液，則應(yīng)拒收。為了判定是否來自下呼吸道的痰，需檢查是否為合格的痰標(biāo)本。一般認(rèn)為來自下呼吸道的合格標(biāo)本應(yīng)該是含膿細(xì)胞和支氣管柱狀上皮細(xì)胞較多，而受唾液污染的來自于頰黏膜的扁平上皮細(xì)胞較少，其判定標(biāo)準(zhǔn)如下表：A、B級的痰標(biāo)本適合進(jìn)行培養(yǎng)；C、D級的標(biāo)本須高倍鏡鏡下觀察區(qū)分，根據(jù)視野內(nèi)的白細(xì)胞或纖毛柱狀上皮細(xì)胞的數(shù)量，以及細(xì)菌的種類及分布等結(jié)果進(jìn)行判定；E級為不合格標(biāo)本。分級白細(xì)胞（個(gè)）/LP扁平上皮細(xì)胞（個(gè)）/LPA＞25＜10B＞2510-25C＞25＞25D10-25＞25E＜10＞25合格痰液標(biāo)本不合格痰液標(biāo)本

3.尿培養(yǎng)標(biāo)本采集規(guī)范正常人尿液是無菌的，而尿液細(xì)菌培養(yǎng)最大的問題是雜菌污染。正常人外尿道有大腸桿菌、葡萄球菌等存在。而這些細(xì)菌又是尿路感染中常見的病原菌。因此要作好尿液細(xì)菌學(xué)檢查，首先應(yīng)注意標(biāo)本收集問題。尿液經(jīng)尿道排出時(shí)會受到尿道內(nèi)正常菌群的污染,但定量培養(yǎng)時(shí)計(jì)數(shù)不會超過103CFU/ml,泌尿系感染時(shí)定量培養(yǎng)在104～105CFU/ml

。另外,由于絕大多數(shù)的泌尿系感染是由腸桿菌科細(xì)菌引起,而此類細(xì)菌的硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)為陽性,故可參考尿檢查常規(guī)中的硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)來推斷是否有細(xì)菌感染。

送檢指征有典型的尿路感染癥狀；有肉眼膿尿或血尿；尿常規(guī)檢查白細(xì)胞或亞硝酸鹽陽性；有不明原因的發(fā)熱，無其他局部癥狀；留置導(dǎo)尿管的患者出現(xiàn)發(fā)熱；膀胱排空功能受損；泌尿系統(tǒng)疾病手術(shù)前；有尿路感染癥狀者，前次培養(yǎng)結(jié)果陰性或抗菌治療48h后仍持續(xù)發(fā)熱?？股赝Ｋ幒螅腥景Y狀再次出現(xiàn)。

尿培養(yǎng)標(biāo)本采集方法標(biāo)本采集應(yīng)在使用抗生素之前，避免消毒劑污染標(biāo)本。清潔中段尿留取清晨清潔中段尿標(biāo)本，先用肥皂水仔細(xì)清洗會陰部，再用清水沖洗尿道口周圍；將前段尿排去，留取中段尿10ml左右于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢，2h內(nèi)接種。該方法簡單、易行，是最常用的尿標(biāo)本收集方法，但是容易受到會陰部細(xì)菌污染。恥骨上膀胱穿刺使用無菌注射器直接從恥骨上經(jīng)皮膚消毒穿入膀胱吸取尿液，是評估膀胱內(nèi)細(xì)菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，主要用于厭氧菌培養(yǎng)或留取標(biāo)本困難的嬰兒尿標(biāo)本的采集。直接導(dǎo)尿按常規(guī)方法對會陰局部進(jìn)行消毒后，用導(dǎo)尿管直接經(jīng)尿道插入膀胱，獲取膀胱尿液，可減少尿液標(biāo)本污染，準(zhǔn)確地反映膀胱感染情況。但有可能下尿道細(xì)菌進(jìn)入膀胱，導(dǎo)致繼發(fā)感染，一般不提倡使用。小兒收集包無自控能力的小兒可用收集包收集尿液，這種裝置由于很難避免會陰部菌群污染產(chǎn)生假陽性，所以只有在檢驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)才有意義。如果檢驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行分析，必要時(shí)可使用膀胱上穿刺或?qū)蚍羧?biāo)本進(jìn)行復(fù)檢。留置導(dǎo)尿管收集尿液用導(dǎo)尿管導(dǎo)取10-15ml尿液置滅菌容器內(nèi)送檢。長期留置導(dǎo)尿管者，應(yīng)在更換新導(dǎo)尿管后留取尿標(biāo)本。留置導(dǎo)尿患者應(yīng)消毒導(dǎo)尿管外部及尿管口，采取無菌操作方法，用注射器通過導(dǎo)尿管吸取尿液。注意防止混入消毒劑，不能從尿液收集袋中采集尿液。

注意事項(xiàng)由于自然排尿收集的標(biāo)本很難避免會陰部及下尿道細(xì)菌污染，所以需要定量接種、合理評價(jià)才能判斷培養(yǎng)的細(xì)菌是否與尿路感染有關(guān)。尿標(biāo)本菌落計(jì)數(shù)中革蘭陰性桿菌數(shù)>105CFU/ml或革蘭陽性球菌數(shù)>104CFU/ml時(shí)有臨床診斷意義。（不是絕對的，受多因素影響，綜合判斷）尿液標(biāo)本的采集和培養(yǎng)中的問題是污染雜菌，故應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

尿標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，以免污染，尿液中不得加防腐劑和消毒劑。除非是流行病學(xué)調(diào)查，長期留置導(dǎo)尿管患者常規(guī)尿培養(yǎng)沒有臨床意義，大量病原菌常可在這類患者中檢出，導(dǎo)尿管留置時(shí)間延長易導(dǎo)致與引起患者尿道感染不一致的微生物定植生長；不可從集尿袋的下端管口留取標(biāo)本，集尿袋內(nèi)的尿液