蘋果部分種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建

蘋果部分種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建

0總結(jié)[研究意義]是世界上最大的蘋果物種起源中心之一。1材料和方法1.1果造成的生長(zhǎng)和測(cè)量131份材料均取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城梨、蘋果圃,包括35份地方品種(1—35號(hào))、77份育成品種(36—112號(hào))和19份近緣野生種(113—131號(hào))(表1)。1.2ssr引物的合成利用德國(guó)QIAGEN的DNeasyPlantMiniKit提取嫩葉基因組DNA。在TP-M13自動(dòng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)中,用3條引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第1條引物是把普通的SSR引物的正向引物分別和M13的反向引物相連合成帶有M13尾巴的引物,即TP-M13引物;第2條引物為正常的SSR反向引物;第3條引物是5′端帶有熒光標(biāo)記的M13正向引物。第1和第2條引物以普通SSR引物加M13接頭生成即為TP-M13-SSR引物。選取已報(bào)道的長(zhǎng)度在100—300bp的普通SSR引物32對(duì)PCR體系和擴(kuò)增產(chǎn)物的純化體系參照高源等1.3s12分析GeneMapper3.0軟件分析ABI3730收集的數(shù)據(jù),獲得不同樣品擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。PopGen32分析獲得的供試材料指紋圖譜數(shù)據(jù),獲得引物多態(tài)性,將每對(duì)引物獲得的等位基因按照從大到小的順序排列,并用阿拉伯?dāng)?shù)字從01開(kāi)始賦值,將每份材料在3個(gè)位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字編碼獲得每份供試材料獨(dú)有的字符串。再利用條碼技術(shù)將每份材料按相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的條碼標(biāo)識(shí)即分子身份證。2結(jié)果2.1引物的篩選條件對(duì)確定引物第一次pcr條件的影響,進(jìn)行條件優(yōu)化并篩選引物。條件道由于TP-M13-SSR正向引物比反向引物多了19bp的M13接頭,使得引物退火溫度較普通SSR引物更易出現(xiàn)擴(kuò)增不穩(wěn)定的情況。因此,必須對(duì)引物第一次PCR條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)引物進(jìn)行篩選。從131份材料中隨機(jī)選取兩份材料,在45—60℃以0.5℃為梯度設(shè)定退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用3%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。最終篩選出穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的16對(duì)TP-M13-SSR引物(包含2對(duì)梨引物),優(yōu)化退火溫度(引物名稱及序列見(jiàn)表2),用于131份蘋果屬植物指紋圖譜構(gòu)建。2.2ssr引物擴(kuò)增多態(tài)性16對(duì)TP-M13-SSR引物擴(kuò)增131份蘋果種質(zhì),共檢測(cè)到326個(gè)等位基因,平均每對(duì)引物對(duì)品種擴(kuò)增的等位基因數(shù)是20.3個(gè)。不同SSR引物擴(kuò)增獲得的等位基因數(shù)體現(xiàn)蘋果種質(zhì)不同位點(diǎn)SSR序列基本單元重復(fù)數(shù)的差異,而不同蘋果種質(zhì)擴(kuò)增獲得的SSR產(chǎn)物片段差異即體現(xiàn)蘋果種質(zhì)之間的差異。16對(duì)引物對(duì)131份蘋果種質(zhì)擴(kuò)增的條帶數(shù)及位點(diǎn)雜合度如表3,從表中可以看出,BGT23b對(duì)種質(zhì)擴(kuò)增的等位基因數(shù)最少為7個(gè),位點(diǎn)期望雜合度最低為0.122;CH05d04對(duì)種質(zhì)擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多為49個(gè),位點(diǎn)期望雜合度最高為0.878;其次是CH01f07a為48個(gè)。等位基因數(shù)超過(guò)平均數(shù)的引物還有CH03d07、CH04e03、CH04h02、CH05b06和CH04g07。引物擴(kuò)增可獲得的等位基因數(shù)越多,期望雜合度越高,表明其更能反映不同品種的差異。利用PopGen32軟件計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量,16對(duì)引物的平均多態(tài)性信息含量為0.7558,高于平均多態(tài)性信息含量的引物有CH03d07、CH04e03、CH04h02、CH05c06、CH02a04、CH05d04、CH01f07a、CH04g07和CH05h12。在等位基因數(shù)高于平均值的引物和多態(tài)性信息含量高于平均值的引物中,共有的為CH05d04、CH01f07a、CH03d07、CH04e03、CH04h02和CH04g07。16對(duì)SSR引物可區(qū)分供試蘋果種質(zhì)資源數(shù)量從11份到71份不等,平均每對(duì)SSR引物可區(qū)分49份蘋果種質(zhì),區(qū)分率為8.09%—52.21%。其中對(duì)蘋果種質(zhì)區(qū)分率最高的是CH01f07a,最低的為BGT23b。只用1對(duì)SSR引物難以將全部供試蘋果種質(zhì)資源分開(kāi)。但是,多態(tài)性信息含量和對(duì)蘋果種質(zhì)區(qū)分率高的引物將在本試驗(yàn)中構(gòu)建蘋果種質(zhì)資源分子身份證價(jià)值最大。2.3最佳引物組合的篩選根據(jù)每對(duì)引物對(duì)全部供試蘋果種質(zhì)區(qū)分率的鑒定結(jié)果,只用1對(duì)SSR引物難以將全部供試蘋果種質(zhì)資源分開(kāi)。分子身份證的最終目的是對(duì)所有供試蘋果種質(zhì)均賦予可辨的分子身份證,而又要同時(shí)滿足用最少的引物區(qū)分最多的蘋果種質(zhì)的要求,否則將會(huì)造成最終構(gòu)建的分子身份證過(guò)余冗繁。因此,有必要通過(guò)逐步增加引物設(shè)定引物組合,篩選可以將全部供試蘋果種質(zhì)可以全部區(qū)分的引物。將多態(tài)性信息含量和對(duì)蘋果種質(zhì)區(qū)分率高的引物即CH05d04、CH01f07a、CH03d07、CH04e03、CH04h02和CH04g07,兩兩組合,鑒定其對(duì)供試蘋果種質(zhì)的區(qū)分率。CH04h02和CH01f07a引物組合分辨率最高,可以區(qū)分120份蘋果種質(zhì);其次是CH04g07和CH01f07a引物組合,可以區(qū)分118份蘋果種質(zhì);再其次是CH05d04和CH01f07a引物組合,可以區(qū)分117份蘋果種質(zhì)(表4)。根據(jù)2對(duì)引物組合的區(qū)分結(jié)果,繼續(xù)增加引物組合的數(shù)量。在增加到3對(duì)引物時(shí),即可將全部蘋果種質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。其中3對(duì)引物為CH04h02、CH05d04和CH01f07a,其為等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量均居前三位的蘋果引物。利用此3對(duì)引物構(gòu)建全部蘋果種質(zhì)的指紋圖譜,其中,寒富和山定子在3個(gè)位點(diǎn)的指紋圖譜見(jiàn)圖1和圖2。2.4材料等位基因信息把可將全部供試蘋果種質(zhì)資源材料全部區(qū)分的3對(duì)TP-M13-SSR引物CH04h02、CH05d04和CH01f07a獲得等位基因按照從大到小的順序排列,并用阿拉伯?dāng)?shù)字從01開(kāi)始賦值(表5)。例如,引物CH04h02對(duì)全部供試材料擴(kuò)增共獲得27個(gè)等位基因,最小的為141bp,最大的為247bp,另外未獲得等位基因的位點(diǎn)記為-9;將等位基因按照從小到大順序排列,并從01開(kāi)始賦值,即141bp等位基因賦值為01,依次類推,247bp等位基因賦值為27,記為-9的位點(diǎn)賦值為28。將每份材料在3個(gè)位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字編碼獲得每份供試材料獨(dú)有的字符串(表1)。例如,綿蘋果在3個(gè)位點(diǎn)CH04h02、CH05d04和CH01f07a獲得的等位基因分別為187bp/195bp、215bp/235bp和194bp/210bp,其對(duì)應(yīng)的賦值數(shù)字分別為07/11、16/23和13/20,按序排列獲得的字符串即為071116231320。再利用條碼技術(shù)將每份材料的按相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的條碼標(biāo)識(shí)即分子身份證。例如:綿蘋果的條形碼分子身份證見(jiàn)圖3。3討論3.1核心引物組合篩選SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記,用于構(gòu)建指紋圖譜的SSR引物定要具備多態(tài)性好、穩(wěn)定性和重復(fù)性高的特點(diǎn)。但是,構(gòu)建蘋果種質(zhì)的分子身份證,還要求用最少的引物數(shù)量區(qū)分最多的種質(zhì)。因此,依據(jù)引物對(duì)蘋果種質(zhì)鑒別的區(qū)分率、引物擴(kuò)增等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量,由高到低,從1對(duì)引物開(kāi)始,逐步增加引物組合的數(shù)量,直至獲得可對(duì)全部蘋果種質(zhì)能夠全部鑒別的引物組合,達(dá)到最少的引物可以區(qū)分最多的蘋果種質(zhì)的目的。并且,保證最終確定的可對(duì)蘋果種質(zhì)進(jìn)行全部區(qū)分的引物具有最高的等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量。利于需要鑒定蘋果種質(zhì)數(shù)量增加時(shí),提高利用相同的引物可對(duì)試材有效區(qū)分的可能性。本試驗(yàn)中篩選的3對(duì)核心引物組合可將全部供試蘋果種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分,在未來(lái)進(jìn)一步的蘋果種質(zhì)的分子身份證構(gòu)建中可以作為參考。本試驗(yàn)中2對(duì)梨引物對(duì)蘋果種質(zhì)的指紋圖譜構(gòu)建具有一定的價(jià)值,但是由于其多態(tài)性遠(yuǎn)低于最終的3對(duì)核心引物,未能在最終的分子身份證構(gòu)建中得到利用。3.2tp-1m3ssr技術(shù)用于構(gòu)建可靠的分子地址熒光測(cè)序技術(shù)與SSR分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的高效和準(zhǔn)確的收集3.3分子身份證編碼技術(shù)DNA指紋圖譜是構(gòu)建分子身份證的基礎(chǔ),分子身份證與指紋圖譜功能相同,但卻是不同的2個(gè)概念。指紋圖譜是指能夠區(qū)分生物個(gè)體之間差異的電泳圖譜,但分子身份證將DNA指紋數(shù)字化,達(dá)到種質(zhì)資源檢索時(shí)更加直觀的目的。相對(duì)于指紋圖譜,分子身份證能夠更加簡(jiǎn)單明了地區(qū)分生物個(gè)體之間的差異。分子身份證一經(jīng)提出,便被賦予種質(zhì)資源本身作為識(shí)別種質(zhì)資源的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。不同研究者在進(jìn)行分子身份證的構(gòu)建時(shí),采用了不同的編碼方法。目前構(gòu)建分子身份證的編碼方法主要有3類這種條形碼標(biāo)識(shí)的分子身份證可以利用條碼掃描器進(jìn)行掃描而更加快速的識(shí)別蘋果種質(zhì),徹底擺脫人工讀取字符串式分子身份證的麻煩。此種蘋果種質(zhì)資源的分子身份證構(gòu)建體系在國(guó)內(nèi)外尚屬首例,這將在建立中國(guó)蘋果種質(zhì)資源的分子數(shù)據(jù)庫(kù),以及蘋果種質(zhì)資源保存和利用研究中有廣闊的應(yīng)用前景。其對(duì)蘋果種質(zhì)資源的高效利用、蘋果新品種識(shí)別鑒定、品種標(biāo)識(shí)、假冒偽劣品種鑒定等方面均有重要的意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。利用條碼技術(shù)將獲得的DNA指紋圖譜信息轉(zhuǎn)化為每份材料獨(dú)有的分子身份證,使得不同蘋果種質(zhì)資源之間分子差異轉(zhuǎn)變成了可見(jiàn)的、并可被機(jī)器快速識(shí)別差異,排除環(huán)境和人為等因素的影響。目前現(xiàn)存的條碼碼制多種多樣,選用條碼時(shí),要根據(jù)信息含量的多少和條碼標(biāo)簽的尺寸大小選擇合適的條碼碼制。國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城蘋果圃保存蘋果資源千余份,種類繁多,類型多樣。近些年,隨著蘋果種質(zhì)資源收集力度加大,資源保存數(shù)量迅速增加。通過(guò)