中藥組學研究的現(xiàn)狀與展望

中藥組學研究的現(xiàn)狀與展望

近年來，在中藥領域取得了著名的研究成果和成果。主要技術背景是化學成分的研究?，F(xiàn)代中醫(yī)研究主要集中在中藥有效成分和病理活性上。藥物成分的合成途徑、積累機制、遺傳生物學背景以及藥物在攝入后如何影響人體環(huán)境內基因等,這些中藥現(xiàn)代化進程中的關鍵問題尚未得到深入研究。2008年,本課題組提出“本草基因組學”概念。本草基因組學(Herbgenomics)是利用組學技術研究中藥基原物種的遺傳信息及其調控網絡,闡明中藥防治人類疾病分子機制的學科,從基因組水平研究中藥及其對人體作用的前沿科學。主要涉及中草藥結構基因組、轉錄組、功能基因組、蛋白質組、代謝組、表觀基因組、宏基因組、基因組輔助分子育種、中藥合成生物學、中藥基因組學、生物信息學及數(shù)據庫等理論與實驗技術。本草基因組學的主要研究內容是生物遺傳背景、遺傳信息,將基因組學和多種組學技術相結合,研究中藥的模式物種體系、合成生物學、藥用植物選種和育種、培育優(yōu)良品種、基因鑒定、代謝途徑等1模式生物體系在近代的醫(yī)學領域,醫(yī)學家常用斑馬魚、線蟲等模式動物進行驗證實驗,植物學領域有擬南芥等模式物種,農業(yè)有水稻、煙草等模式物種進行科學研究。這些學科的研究成果都有基因組背景清楚的模式生物體系來支撐,各項研究成果在實驗室中可以被重復、驗證和證實,容易得到國際主流科學家的認可,比如僅線蟲的相關研究就產生過3個諾貝爾獎得主。一直以來,中藥缺少一個模式物種體系,相關研究成果在其他國家、研究機構不能被有效的驗證,因而較難在國際頂級學術期刊上發(fā)表,研究成果的認可度也會受到影響。為此,本課題組進入基因組學領域進行研究,為中藥模式物種體系的建立奠定基礎。1.1真菌原生代謝產物研究2012年,本課題組提出靈芝成為首個藥用模式真菌,通過基因組解析技術研究真菌次生代謝產物發(fā)現(xiàn),靈芝是一種非常好的模式生物。這項工作對后續(xù)功能基因發(fā)掘、有效成分合成途徑、品種選育以及指導生產都起到了很好的推動作用。目前,本課題組朱英杰博士等完成的基因組學揭示靈芝的生物活性機制1.2中藥資源戰(zhàn)略合作本課題組前期從事藥用植物研究,相關研究成果難以在植物學頂級期刊上發(fā)表。2016年,我們在丹參基因組基礎研究的基礎上進行了丹參基因組學研究,與廣藥集團開展中藥資源研究戰(zhàn)略合作,共同解析丹參基因組。隨著高雜合度、高復雜度丹參基因組的測序和組裝完成,為其他藥用植物基因組解析提供了可行的研究策略,該項成果通過選育丹參雄性不育系,突破中藥材雜種優(yōu)勢育種技術難題,“中丹1號”、“中丹2號”通過新品種鑒定。由此可見,得到一個大的基因組學研究背景的支撐對中藥研究水平會有很大提升,且對品種選育研究也有很好的促進作用。2轉錄組研究數(shù)據轉錄組學信息是基因組研究的基礎信息和核心數(shù)據,中藥比較轉錄組研究為中藥功能基因組研究提供有效候選基因,基于轉錄組數(shù)據發(fā)掘的SSR是分子育種研究中的有效分子標記。2.1品種選育和育種為解決三七原植物的連作障礙問題,本課題組通過前期大量轉錄組學研究。從三七根莖轉錄組獲得30.852條單一序列,其中70.2%為注釋序列挖掘11條參與三萜皂苷生物合成途徑的基因特別是宏基因組學的研究,通過和三七研究院和云南苗鄉(xiāng)三七公司合作,在自然病圃中獲得母本,經人工病圃純化后,建立抗病群體并采用Restriction-siteAssociatedDNASequencing(RAD-Seq)測序技術篩選抗病株的特異SNP位點輔助系統(tǒng)選育。通過傳統(tǒng)的單株選育及集團選育并結合現(xiàn)在分子生物學技術,有效縮短了三七的選育年限,加快育種進程。通過選育使三七根腐病的發(fā)病率下降了62.9%,有顯著的抗病性?？共∪后w包含12個特異的SNP位點,具有特異的基因型。通過以上工作,最終篩選出三七抗性新品種“抗七1號”。通過上萬株三七的標記、篩選,該項目實際工作量非常大,基因組學研究技術大大地加快了篩選工作、品種選育過程。2016年9月,通過植物新品種登記專家田間鑒定、評審,命名為“苗鄉(xiāng)抗七1號”。這些基礎研究工作與行業(yè)實際需求及大田生產結合,產生了很好的經濟和社會效益。2.2生態(tài)適宜性分析信息系統(tǒng)對同屬植物人參和三七可以采用相似的研究方法和技術,不過人參的生長周期更長,所以一般需要做3-4代才能確定一個優(yōu)選品種。目前,農田栽參已經有了大的突破,這項工作已進行多年,現(xiàn)在已經開始大田推廣。為避免人參“與糧爭地”,本課題組進行了人參全球產地生態(tài)區(qū)劃研究(圖2),并建立了中藥材產地生態(tài)適宜性分析地理信息系統(tǒng)(TraditionalChineseMedicineGeographicInformatinSystems,TCMGIS),在全世界范圍內尋找適合種植人參的國家和地區(qū),該系統(tǒng)每1平方公里可以采到3個數(shù)據點,數(shù)據精準、可靠、覆蓋面全,已獲得廣泛認可。利用該系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)原產地以外的適宜生長區(qū),在生態(tài)適宜區(qū)人工種植稀缺、貴重藥材,滿足日益增長的藥材需求量。例如,中國不是西洋參的分布區(qū),但中國是西洋參的生態(tài)適宜區(qū),通過多年的研究和時間探索,2012年中國西洋參的產量已經高于西洋參原產國美國,總產量僅次于加拿大,位列世界第二,產生了很高的社會效益和經濟效益。2.3中藥體內代謝基因組研究中藥體內代謝基因組研究是促進精準醫(yī)療的一個非常重要環(huán)節(jié)(圖3)。中藥體內代謝及藥效發(fā)揮的基本環(huán)節(jié)是藥物分子與機體生物分子之間直接或間接的相互作用,引起從遺傳信息到整體功能實現(xiàn)過程中多個層面的結構與功能狀態(tài)的改變,而決定這些層面的結構與功能的基礎是基因。因此,以基因表達、調控及修飾為研究方向,進行中藥多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點的體內研究,可能有助于闡明中藥體內代謝過程和分子作用機制。同時,人個體也是一個生物環(huán)境,除了人自身的遺傳物質,還有來自于分布人體各部位的微生物基因,其中腸道是微生物種類數(shù)目最高的器官。近年來,基于基因組學的技術在中藥體內代謝領域進行了有益的探索。因此,有必要探討中藥體內代謝基因組相關研究,包括中藥對人自身基因的影響和對人體微生物基因組的影響。有些中藥是以其單體成分為目標進行新藥研制研究,如人參皂苷等。另外,還有一些藥物是以藥物化學全合成、結構修飾的方式研發(fā)出來。根據相關領域的研究總結,本課題組在本草基因組研究基礎上提出“中藥合成生物學”3補充劑、中草藥、銀杏葉偽造事件眾所周知,目前市場上的中藥材比較混亂,藥材粉末更是“神仙難辨”,針對藥材某些藥用部位進行造假的技術手段更是層出不窮。2015年,沃爾瑪?shù)让绹?大零售商涉嫌草藥補充劑造假,被紐約州當局要求下架,這個中藥國際化發(fā)展進程中的大事件,直接導致2015-2016年我國提取物和中草藥的出口量顯著下降。該事件的原因是,美國藥監(jiān)部門檢測到有草藥補充劑造假現(xiàn)象,被檢藥材中沒有原物種的DNA,部分草藥補充劑商品系人工造假產物。另外,國際上還出現(xiàn)過“銀杏葉造假事件”,當時我國境內也查出有不良商家用槐米造假來充當銀杏葉的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象導致中醫(yī)對中藥的不認可,并有人提出“方靈藥不靈”的說法。更嚴重的是,香港“洋金花與凌霄花混用中毒事件”、菊三七誤當三七導致嚴重肝毒性,以及全球最大草藥醫(yī)療事件——馬兜鈴腎病,將關木通與木通誤用,廣防己與防己誤用等,這些誤用嚴重威脅國民健康和人身安全。3.1植物鑒定的準確性如果僅僅通過檢測藥材的一個部位,根據其性狀鑒定、基原鑒定、顯微鑒定和理化鑒定,要鑒定到物種水平是非常困難的。比如根類藥材就不具備分類的核心特征,植物分類主要是以花和果實進行鑒定。加之現(xiàn)在世界貿易帶來的藥材廣泛流通,對藥材鑒定造成更大的困難,因此需要尋找更有普適性的鑒定方法(表1)。世界上有20多種甘草,一個藥材經藥檢所鑒定,結果不會顯示具體的物種名稱,只能確定是否與藥典描述的藥材相符。如果藥材來源都不清楚,后期再做含量測定等精確計算就很難保證準確性。為此,我們要尋求一種基因鑒定的方法。3.2u3000eths2鑒定對中藥鑒定作用的初步研究DNA條形碼鑒定法是在所有正品藥材中找到相同的一段DNA片段進行測序,保存在數(shù)據庫中作為對照品用來鑒定未知樣品或易混淆樣品。國際條形碼協(xié)會植物工作組提出的兩個葉綠體片段——rbcL和matK,兩者加在一起使用鑒定效率為72%。本課題組有基因組的研究優(yōu)勢,通過大樣品量的實驗確定了條形碼序列的篩選范圍,從而找到約220bp的核基因組片段ITS2作為通用條形碼,突破了當時對DNA條形碼序列長度范圍500-800bp的定義,通過大樣本量驗證發(fā)現(xiàn)ITS2序列有很好的擴增效率和鑒定能力,數(shù)千份的樣品中達到92.7%的樣品都能鑒定準確。該研究發(fā)表的第一篇文章被引用820多次,在隨后的研究中,本課題組在國際上首次明確ITS2多拷貝有利于物種鑒定。在以上研究工作中,本課題組一共檢測4.8萬份中藥樣品,涉及217科1251屬的1.1萬個物種。所有樣本均采用原植物,從全國4大藥用植物園里找到所有正品藥材的原物種;對于部分植物園采不到的物種,到野外采集樣品后,與英國皇家植物園核對,經國內權威專家鑒定無誤后才會使用。本課題組在中檢院購買了所有的對照藥材,這些鑒定工作是由各大藥檢所來復核樣本。在核對機制方面,應用BLAST分析、BarcodingGap分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析等分析技術。為了證實ITS2能高效鑒定近緣科屬種藥材(中草藥及其混偽品),本課題組專門就中草藥近緣物種(易混品)進行了評估驗證研究。另外,還對《中國藥典》收載的根莖類藥材及其混偽品5860份、花類藥材602份、全草類藥材及其混偽品2431個物種、皮類藥材312份、果實類藥材1352份進行了研究,發(fā)現(xiàn)ITS2能準確穩(wěn)定鑒定生藥及其混偽品。另外,對于部分藥材還能做種下的道地藥材鑒定,比如川麥冬和浙麥冬的鑒別、不同地區(qū)肉蓯蓉的區(qū)分及野外考察及生態(tài)型分布,ITS2是很好的一種鑒定方法。3.3葉綠體全基因組的鑒定作為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補充,DNA條形碼分子鑒定方法近年來發(fā)展迅猛,但對于某些近緣物種,尤其是種下等級的準確鑒定,DNA條形碼序列也存在一定的局限性。隨著測序技術的發(fā)展以及測序成本的下降,第二代和第三代高通量測序技術越來越多的應用于藥用植物的研究中,應用高通量測序技術獲取藥用植物葉綠體全基因組的方法已經很成熟。將葉綠體全基因組作為超級條形碼來進行物種鑒定,或應用葉綠體全基因組篩選種屬特異的DNA條形碼序列是某些近緣物種或種下等級準確鑒定的一個方向。本課題組基于SMRTPacBio技術獲取了三種貝母屬物種的葉綠體全基因組序列,并對葉綠體全基因組進行全局分析,查找基因區(qū)域和基因間區(qū)的高變異區(qū)域,篩選出7個基因間區(qū)作為潛在的貝母屬物種鑒定的特異性DNA條形碼序列,為難鑒定科屬篩選DNA條形碼序列提供了參考。綜上所述,本課題組由此創(chuàng)建了全新中草藥DNA條形碼物種鑒定體系:鑒定方法的標準操作流程有:(1)供試品處理;(2)DNA提取;(3)PCR擴增;(4)條形碼序列的獲取;(5)結果判斷;中草藥鑒定平臺包括標準化中草藥DNA條形碼數(shù)據庫和網絡鑒定操作平臺;鑒定軟件系統(tǒng)有DNA拼接軟件和中藥DNA條形碼鑒定軟件。該體系的組織構成以ITS2為主體序列,以psbA-trnH為輔助序列,適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片)及基原物種的鑒定。國際期刊BiotechnologyAdvances以“草藥鑒定從形態(tài)到基因的文藝復興”刊發(fā)了該研究成果。3.4藥事鑒定中快速鑒定的應用技術目前,2010版和2015版《中國藥典》已經納入DNA條形碼分子鑒定法指導原則,課題組編著了《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》;2015年5月,英國藥典委員會專門派兩名專家到國家藥典委員會申請學習DNA條形碼技術,《英國藥典》在2016年引進了草藥DNA鑒定技術;美國藥典委員會多次與本課題組聯(lián)系,希望將ITS2應用到西洋參等草藥的鑒定研究中,邀請本課題組協(xié)助建立草藥鑒定標準?，F(xiàn)在,我們又將DNA條形碼鑒定技術應用在中成藥鑒定領域。比如當歸成藥鑒定方面,通過當歸及近緣種265份ITS2序列分析,找到當歸獨有的SNP,開發(fā)了一段37bp的分子身份證,GenBank中當歸屬72個種429條ITS2序列,僅當歸具有此分子身份證。應用該分子身份證對28份中成藥進行鑒定,7份樣品檢測結果為獨活、羌活、藁本、紫花前胡等非標簽成份。這一研究拓寬了DNA條形碼技術在降解嚴重樣品中的應用。為了讓企業(yè)進行快速鑒定,我們專門研究應用比色法來判斷物種的快速鑒別技術。如對西紅花及其混偽品應用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)進行快速鑒定,通過對西紅花及其混偽品設計LAMP特異性擴增引物,西紅花樣本經LAMP擴增后,呈綠色熒光,而混偽品樣本為橙色,目測即可進行快速鑒別,為企業(yè)節(jié)省了寶貴的時間。本課題組對以上技術進行了產權保護,國內外首創(chuàng)中草藥DNA條形碼物種鑒定體系獨家專利。在論文成果方面,本課題組在BiotechnolAdv、NatureCommun、PNAS、BiolRev、中國科學等發(fā)表論文165篇,被PNAS、Science、MBE等國際著名期刊引用;國內發(fā)表的論文中3篇DNA條形碼研究論文入選中國百篇最具影響優(yōu)秀國內學術論文。在應用方面,國際上大量的研究機構、檢驗機構和企業(yè)都在用我們的技術,種子、種苗的鑒定也可以用這種技術,我們培訓了很多技術人員,國內最大的中醫(yī)院廣東省中醫(yī)院、湖北省中醫(yī)院都在用這個技術,其中廣東省中醫(yī)院每天要用12噸的中藥材飲片,他們非常重視藥材的基原物種問題;許多知名藥企也是非常重視藥材原物種的鑒定,以確保所用品種是法定來源,保證產品的安全性和療效;日本最大漢方企業(yè)津村安排專人提供的藥材防風樣品來我們課題組進行檢測,結果顯示樣品為華山前胡,為企業(yè)成功避免遭受損失;貴重藥材、草藥飲料、偵破案件等領域也在使用這個技術。在國際合作方面,日本國津村株式會社、美國Unigen、安利等都就DNA條形碼鑒定技術與我們開展了廣泛的合作。另外,中草藥DNA條形碼物種鑒定體系研究獲得了國家科技進步二等獎、教育部科技進步一等獎、中華中醫(yī)藥學會自然科學一等獎,入選“2014年度世界中醫(yī)藥十大新聞”。項目負責人在國際生命條形碼大會應邀做主題報告,擔任藥用植物分會主席。中草藥DNA條形碼物種鑒定體系已經成為國際國內的亮點。在這個過程中我們有一個體會,中醫(yī)藥作為一個應用學科,還是要先把其中的原理、背景研究清楚,才能有更長久、更好的發(fā)展。3.5維dna條碼信息課題組基于開源代碼PHPQRCode編碼方式將DNA條形碼序列轉換為二維碼,應用移動終端的二維碼掃描軟件識別可獲得物種拉丁名及序列信息,通過移動終端的瀏覽器可在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進行物種鑒定。二維DNA條形碼可應用于中藥材流通監(jiān)管領域,DNA條形碼序列獲得及DNA條形碼信息跨平臺轉換,能夠有效實現(xiàn)對中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管,推動中藥材流通監(jiān)管現(xiàn)代化、國際化進程。另外,我們和澳門大學課題組合作進行了道地藥材品質溯源研究(圖4)。4“中間提取物”標準湯劑概念的確立中藥飲片標準湯劑是以中醫(yī)理論為指導、臨床應用為基礎,參考現(xiàn)代提取方法,經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。在定位方面,中藥飲片標準湯劑可以用于標化臨床用藥,保障用藥的準確性和劑量的一致性,它的作用包括:(1)有利于臨床用藥的準確和劑量的統(tǒng)一;(2)有利于保障療效的一致性;(3)有利于促進用藥質量提高,改變目前監(jiān)管困局;(4)為中藥研究標準化提供了基礎;(5)有利于促進制造工藝和管理的改善和提升。中藥絕大部分是復方,目前新藥審批方法、管理辦法有一些不太科學的規(guī)定,比如現(xiàn)有成藥生產管理要求固定的(如100kg)藥材原料要生產固定的(如10000粒)膠囊數(shù),但是原料藥材有效成分的含量不是固定的,這種原料的有效成分含量、出膏率等指標都不一樣,生產的產品差別就很大,很難做到均一穩(wěn)定。在和日本津村合作過程中發(fā)現(xiàn)他們幾十年生產的成藥樣品含量都非常的穩(wěn)定,他們核心的方法就是中間設置標準湯劑,簡單來講就是“中間提取物”,相當于西醫(yī)的“原料藥”,目前我們中成藥新藥生產工藝里是沒有這個概念的,這個想法在藥典委和各位專家討論過,討論中反對這一做法的原因就是中間提取物造假更容易,以后監(jiān)管起來更難。但是,如果我們現(xiàn)在最基本的均一穩(wěn)定都做不到,穩(wěn)定可控的“精準”之路更是難上加難。前不久,藥監(jiān)局針對中藥配方顆粒引入了標準湯劑概念(《中藥配方顆粒管理辦法(征求意見稿)》,2015年第283號),每種藥材標準煎劑作為最原始的標準,通過這種“中間提取物”的方式來監(jiān)管、控制。比如金銀花標準湯劑,把有代表性GAP產地的金銀花飲片按照傳統(tǒng)的標準煎煮規(guī)范(容器大小、水量、溫度、時間)確定出膏率、有效成分得率,在這些步驟的基礎上確立標準,基于此后面生產顆粒劑時就有了一個基本可控的范圍,有了標準湯劑這個中間參照物,顆粒劑就有相對均一、穩(wěn)定的產品。值得思考的是,中藥新藥是不是也可以引入標準湯劑的概念,對后面的成藥穩(wěn)定性是很重要的因素。5中醫(yī)藥產業(yè)面臨的機遇和挑戰(zhàn)1986年,國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥物審評中心將第一個新藥證書(86衛(wèi)藥證字X-01號)(92衛(wèi)藥證字X-66、67號)頒發(fā)給中國中醫(yī)科學院中藥研究所屠呦呦教授開發(fā)的青蒿素。當時,該項新藥研究項目