接種病原菌lxyli的拉氏菌對蔗莖維管組織的影響

接種病原菌lxyli的拉氏菌對蔗莖維管組織的影響

甘蔗殘留癥（gsd）是世界甘蔗最常見的疾病之一。由這種類型的囊性甲殼類細菌中的xylisubp（l33）引起的細菌大小為（0.25.50）m（1.004.00）m。1材料和方法1.1材料表面選擇RSD易感甘蔗品種‘Badila’，利用Lxx-PCR檢測1.2方法1.2.1蔗汁的純化按圖1所示取蔗莖不同部位，蔗莖在流水中沖洗5min，去皮，將蔗莖切成約1cm×1cm×3cm大小。用鉗子榨取蔗汁于2mL離心管中并立即放入冰盒中，以減少蔗汁褐變，3000r/min離心2min，取上清，5000r/min離心1min后棄上清，用PBS緩沖液重懸浮。參照TIANampBacteriaDNAKit細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書進行操作。1.2.2樣品制備和成型參照Carvalho等(1）前固定：將不同組織部位材料，用刀片切成截面1mm×1mm，長3mm大小，置于0.2mL離心管中，做好標記，加入已配置好的2.5%戊二醛溶液，抽真空趕走氣泡，使固定液和組織充分接觸，置于4℃，3h。(2）洗滌：倒掉固定液，用0.1mol/L,pH為7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次30min。(3）后固定：用1%的鋨酸溶液固定4℃過夜。(4）洗滌：液洗滌3次，每次30min。(5）丙酮脫水：10%～90%丙酮逐級脫水，每級20min,100%丙酮脫水3次，每次30min（整個過程在搖床上進行）。(6）包埋：樹脂配方參照EMbed812Kit說明書（MixingInstruction），丙酮∶不完全樹脂=3∶1,2h；丙酮∶不完全樹脂=1∶3,4h；不完全樹脂，過夜（干燥器內(nèi)不加蓋過夜）；完全樹脂，48h（中間換新鮮完全樹脂1次）；包埋，先于干燥器中放置12h，后將其擺正，最后于70℃烘箱中1～2d.(7）半薄切片：在制刀機上制備好玻璃刀，于超薄切片機上對修好的包埋塊樣品切成1μm的半薄切片。(8）鏡檢觀察：1%甲苯胺藍染色，顯微鏡鏡檢觀察。2結(jié)果與分析2.1甘蔗下頜莖節(jié)菌量的變化感染RSD的‘Badila’蔗株莖部由基層到尾層，Lxx菌量呈現(xiàn)遞減趨勢，甘蔗基部莖節(jié)處Lxx含菌量最高，基部莖間相對莖節(jié)Lxx菌含量下降了44.89%，中間莖間相對莖節(jié)含量下降了49.26%，而頂端莖間相對莖節(jié)下降18.46%，但經(jīng)統(tǒng)計學分析各部位的菌量差異未達到顯著水平。2.2異形木質(zhì)部染色對健康蔗株和RSD蔗株根帶芽處進行橫向切片發(fā)現(xiàn)（圖4),RSD芽軸、芽原基染色較深（圖4A1，圖4a1）。通過對莖部根帶、莖間的維管組織切片發(fā)現(xiàn)，健康蔗株維管組織結(jié)構(gòu)相較于RSD蔗株完好，主要差異體現(xiàn)在韌皮部和近導管處（圖4A2，圖4a2），此外莖節(jié)處的異形木質(zhì)部內(nèi)染色較重，存在不明內(nèi)容物（圖4a2）。對莖基部、中部、頂部3層維管組織進行的切片鏡檢結(jié)果顯示，RSD蔗株基部和中部的維管組織結(jié)構(gòu)破損嚴重，中間的原形成層細胞散裂明顯（圖4a3，圖4a4），頂端蔗莖維管組織結(jié)構(gòu)完好清晰（圖4a3，圖4a4，圖4a5），健康蔗株與RSD蔗株一樣，基部維管組織染色較深，但基部、中部、頂部維管組織，結(jié)構(gòu)完好，差異不大（圖4A3，圖4A4，圖4A5）。從莖節(jié)和莖間的局部縱切面的維管組織切片發(fā)現(xiàn)（圖5），無論是健康的還是感病的甘蔗莖節(jié)的基本細胞相較于莖間的小得多，且具有木質(zhì)部異形、細胞大小不一、細胞整體較為密集的情況，推測莖節(jié)的組織結(jié)構(gòu)在一定程度上阻礙了病原菌的向上運輸。3維管束劍與緣生性胞的排列方式不同甘蔗莖為實心，可分為表皮、皮層、基本組織、維管束4個部分。表皮外被有明顯的角質(zhì)層，下皮層以內(nèi)是不同程度加厚的皮層細胞，維管束貫穿于基本組織中，分散于整個切面內(nèi)，靠邊緣的維管束和靠中央的維管束在鞘細胞的排列方式上是不同的。靠邊緣的維管束導管口徑較小，但維管束鞘較發(fā)達，向心加厚；靠中央的維管束導管口徑較大，維管束鞘不如邊緣維管束明顯，成典型帽狀分布，即在韌皮部和木質(zhì)部均有厚壁細胞?；窘M織由薄壁細胞組成，分布于皮層內(nèi)部維管束之間，維管束相互連接構(gòu)成維管系統(tǒng)，主要作用是為植物體輸導水分、無機鹽和有機養(yǎng)料等，也有支持植物體的作用。胡敏過去的研究發(fā)現(xiàn)，Lxx侵染甘蔗后主要集中在其甘蔗莖基部2～3節(jié)間處RSD的主要傳播途徑是收獲機械、刀具以及帶病的蔗種4lx菌量分布感染RSD的蔗莖維管組織