利用ssr熒光標記構(gòu)建山東地方梨種質(zhì)資源分子身份證

利用ssr熒光標記構(gòu)建山東地方梨種質(zhì)資源分子身份證

梨最早起源于中國西南部，有3000多種種植品種。根據(jù)起源和地理分布，中國的梨一般分為四種系統(tǒng)：白梨、沙梨、秋子梨和新疆梨。SSR(simplesequencerepeats)標記具有多態(tài)性豐富、共顯性、穩(wěn)定性好、易于檢測等優(yōu)點,在多樣性分析、品種鑒定、遺傳作圖、基因定位等領(lǐng)域得到了廣泛的應用隨著梨屬植物SSR引物的陸續(xù)開發(fā),SSR技術(shù)已廣泛用于梨屬植物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定和分子身份證構(gòu)建等研究1材料和方法1.1種質(zhì)資源實行來源試驗于2016年6月至2017年10月在山東省果樹研究所進行。供試的45份材料采自國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系泰安綜合試驗站天平湖核心示范園種質(zhì)資源圃(表1)。每個品種隨機選取3株,取幼嫩葉3～4片,混合后用錫箔紙包好,置于冰盒帶回實驗室,液氮冷凍后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2ssr引物的篩選和篩選采用MagneSphereMagneticSeparationProducts(Promega)試劑盒磁珠富集短基因組DNA,產(chǎn)物純化后進行克隆并篩選,建立SSR富集文庫,從中開發(fā)并設計分布于梨17個連鎖群的40對引物,引物由上海生工生物工程公司合成,HAP純化。采用丙烯酰胺凝膠電泳對初篩合格的引物進行復篩,從中篩選出擴增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的10對引物用于樣品擴增。正向引物的5’端加1個FAM熒光標記,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表2)。1.3提取dna和pcr系統(tǒng)采用CTAB法提取樣品總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度,并將濃度稀釋至50ng·μL1.4毛細管電泳檢測對PCR擴增產(chǎn)物進行純化,將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后,取15μL加入上樣板中,再加入1μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物,然后使用美國ABI3730XL測序儀進行毛細管電泳。待電泳結(jié)束后,利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析,將各泳道內(nèi)分子質(zhì)量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析,得到片段大小。利用軟件POPGENE32分析數(shù)據(jù)獲得引物擴增的等位基因數(shù)、擴增帶型、樣品在不同SSR位點的基因多樣性和多態(tài)性信息含量。1.5擴增帶型的編碼利用10對引物對45份樣品進行擴增,得到各樣品擴增的指紋數(shù)據(jù),將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼,即分子身份證。轉(zhuǎn)換方法如下:將每對引物在某一樣品上擴增出的每一種帶型用個位阿拉伯數(shù)字1、2、3、……、9編碼表示,為保證每一種帶型只占一位數(shù)字,帶型數(shù)大于9時,分別用a、b、c代表第10、11、12種帶型,依次類推,無帶用0表示,這樣,每種引物在某一樣品上的擴增帶型用1位數(shù)字或字母表示;按照引物擴增帶型數(shù)由少到多的順序,將每個樣品在10對引物上的擴增帶型數(shù)據(jù)串聯(lián)起來,即得到每個樣品以10位數(shù)字或字母表示的分子身份證2結(jié)果與分析2.1引物和帶型檢測結(jié)果如表3所示,10對SSR引物對45份梨種質(zhì)資源進行擴增,共檢測到111個等位位點,每個引物檢測到的等位位點4～19個,每對引物平均11.1個。共檢測到189個帶型,每個引物檢測到帶型數(shù)8～26個,每對引物平均18.9個。擴增的片段長85～295bp。圖1為引物P5對‘桑皮梨’‘面梨子’和‘槎子梨’的擴增帶型。2.2分子身份證編碼按表2引物的順序即P5、P9、P10、P14、P17、P18、P19、P27、P34和P37,將每對引物在樣品上擴增的帶型編碼進行串聯(lián)排列(表4),得到45份山東地方梨種質(zhì)資源的分子身份證代碼,在對應的位置上,代碼相同表示該引物在樣品上擴增帶型相同(表5)。結(jié)果表明,得到的45份供試材料的分子身份證代碼均不相同,能夠?qū)⑺蟹N質(zhì)資源區(qū)分開。3分子身份證的初步構(gòu)建SSR標記具有高穩(wěn)定性和高準確性等優(yōu)點,目前主要通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光標記分析技術(shù)檢測SSR擴增產(chǎn)物迄今為止,從梨基因組序列、EST和NGS等數(shù)據(jù)庫已開發(fā)了1000多對SSR引物對于分子身份證的構(gòu)建,不同研究者采用的編碼方法不一致地方種質(zhì)資源往往具有很多優(yōu)良的特異性狀,是抗逆育種和品質(zhì)育種的寶貴基因庫。目前,山東地方梨種質(zhì)資源急劇減少,90%以上的資源遭到破壞,迫切需要收集保護,分子身份證的構(gòu)建對于種質(zhì)資源精準鑒別和保護利用非常重要。本研究初步構(gòu)建了45份山東地方梨種質(zhì)資源的分子身份證,可為這些種質(zhì)資源的準確鑒定提供依據(jù)。今后將進一步加大對山東地方梨種質(zhì)資源的收集力度,通過構(gòu)建分子身份證,生成每份種質(zhì)資源的特異標識,從而快速高效地鑒定梨種質(zhì)資源,有效避免資源收集的重復,甄別同名異物及同物異名資源,提高種質(zhì)鑒定和評價的效率。4分子身