新版體內藥物分析

生物樣品內藥品分析任務1.在藥品濃度監(jiān)測中應用

2.在藥代動力學研究中應用

3.分析方法學研究

新版體內藥物分析第1頁1.干擾雜質多2.樣品量少3.要求較快提供結果。生物樣品內藥品分析特點新版體內藥物分析第2頁第一節(jié)生物樣品種類、采集、制備與貯存第二節(jié)生物樣品預處理與制備第三節(jié)體內樣品分析方法與驗證內容提要新版體內藥物分析第3頁一、生物樣品種類、采集和制備

血液(血漿、血清)—表達藥品濃度和治療作用之間關系——最慣用生物樣本

生物樣品臟器組織體液血液、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等新版體內藥物分析第4頁（一）血液（blood）

因血液中藥品濃度能夠很好地表達藥品濃度和治療作用之間關系，是最為慣用生物樣品—分為全血、血漿和血清

新版體內藥物分析第5頁（一）血液

1.血樣采集

供測定血樣應能代表整個血藥濃度，因而應待藥品在血液中分布均勻后取樣。

動物試驗時，可直接從動脈或心臟取血。

對于病人，通常采取靜脈血。一、慣用樣品種類、采集和貯藏新版體內藥物分析第6頁

（1）血漿(plasma)制備：

血液置含有抗凝劑（如：肝素、草酸鹽等）試管中，混合后，離心，分離血細胞，淡黃色上清液即為血漿。

普通1ml全血需加0.1—0.2mg肝素。加入血樣后馬上輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免造成血細胞破裂。新版體內藥物分析第7頁(2)血清制備

采集靜脈血液置試管中，放置30min到1h，因為激活了一系列凝血因子，血中纖維蛋白原形成纖維蛋白，血液逐步凝固，離心后上層澄清淡黃色液體即為血清。

新版體內藥物分析第8頁（3）全血制備

采集血液置于含有抗凝劑試管中，輕輕混勻，不離心，預防凝血，保持血漿和血細胞混合在一起。

新版體內藥物分析第9頁血漿比血清分離快，而且制取量約為全血50%~60%（血清為全血20%~40%），多數(shù)用血漿進行分析。若血漿中含有抗凝劑對藥品濃度測定有影響時，則應使用血清樣品

血漿與血清區(qū)分新版體內藥物分析第10頁

全血制備成分血漿有形物質紅細胞白細胞血小板新版體內藥物分析第11頁

血樣主要應用于：

藥品動力學生物利用度臨床治療藥品濃度監(jiān)測新版體內藥物分析第12頁（二）尿液(urine)

尿液用于藥品劑量回收、藥品尿去除率、生物利用度研究，預測藥品代謝過程、類型體內藥品去除主要是經(jīng)過尿液排出，藥品以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等各種形式排出

新版體內藥物分析第13頁（二）尿液(urine)

性狀—淡黃色或黃褐色，相對密度1.105-1.020，pH4.8-8.0成份—水、含氮化合物、鹽類等微生物—防腐劑新版體內藥物分析第14頁尿液采集

樣本起源—自然排尿，成人一日排尿量為1~5L（隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿）

樣本采集—普通采集時間尿（要求時間內）采集尿液體積和排入尿中藥品總量

動物試驗中用代謝籠搜集尿、糞，只能以時間段采集，有時會有搜集不到情況。新版體內藥物分析第15頁新版體內藥物分析第16頁

尿樣優(yōu)點：輕易取得，屬非損傷性取樣，且樣品量大；尿中藥品濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結構首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。缺點：與血藥濃度不相關，難以反應藥品作用過程；受腎功效、pH影響；難以定時定量取樣，易污染；所含成份復雜，已知其中有紫外吸收化合物就達數(shù)十種。尿樣測定多用于藥品排泄、生物轉化研究。新版體內藥物分析第17頁（三）唾液（saliva）

唾液—無損傷取樣，易搜集；一些藥品唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)親密相關，所以： —TDM中利用對S測定代替對P監(jiān)測 —藥代動力學研究

新版體內藥物分析第18頁唾液采集

在潄口后15min，平靜狀態(tài)下采集口腔內自然流出唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)

新版體內藥物分析第19頁唾液采集

物理法：口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等化學法：將檸檬酸或維生素C等置于舌尖，棄去初始部分后采集化學法優(yōu)點：縮短采樣時間減小唾液pH波動（pH≈7.0），S/P個體差異小新版體內藥物分析第20頁

唾液樣品采集后，應馬上測量其除去泡沫部分體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保留 唾液樣品制備新版體內藥物分析第21頁

非傷害性方法，病人易接收采集不受時間、地點限制，易搜集

一些藥品唾液藥品濃度(S)與血漿游離藥品濃度(P)親密相關，可使用唾液樣品唾液樣品特點新版體內藥物分析第22頁

TDM—如苯妥英鈉Cs/Cp比值恒定、個體差異小，可用于癲癇病人TDM 藥代動力學參數(shù)測定—用GC-MS分析測定可卡因，血漿和唾液中t1/2分別為3.8h和7.9h唾液樣品應用新版體內藥物分析第23頁（四）器官組織（tissue）

1．勻漿化法

加入一定量水或緩沖液，在刀片式勻漿機中勻漿，使被測藥品溶解，取上清液供萃取用—方法簡單、但回收率低組織處理普通方法有：用于動物試驗藥品動力學研究臨床服用藥品引發(fā)中毒死亡新版體內藥物分析第24頁2．沉淀蛋白法

在組織勻漿中加入蛋白沉淀劑，沉淀蛋白質后取上清液供萃取用，操作簡單、但回收率低，較為慣用新版體內藥物分析第25頁3．酸水解或堿水解

組織勻漿中加入適量酸或堿，置水浴中加熱，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用適用對熱穩(wěn)定藥品，應用較少。新版體內藥物分析第26頁

組織勻漿中加入適量酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用最慣用酶—枯草菌溶素（一個細菌性堿性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0較寬范圍內使蛋白肽鍵降解，在50~60℃含有最大活力）

返回去除蛋白質方法4．酶水解法新版體內藥物分析第27頁

優(yōu)點—酶解法操作簡便 —防止藥品在酸及高溫下降解 —對與蛋白結合緊密藥品，可顯著改進回收率 —可用有機溶劑直接萃取酶解液而無乳化現(xiàn)象生成

缺點—不適合用于在堿性下易水解藥品返回去除蛋白質方法4．酶水解法新版體內藥物分析第28頁

（五）頭發(fā)（hair）

應用—體內微量元素含量測定—用藥史預計—臨床用藥和藥品非法濫用區(qū)分、毒性藥品檢測新版體內藥物分析第29頁優(yōu)點—取樣方便、可重復采樣 —經(jīng)過測定一些特定代謝物將

藥品濫用和臨床用藥相區(qū)分 —能獲數(shù)月~多年長久用藥信息缺點—預處理繁雜、干擾多 —分析對象含量低、需精密儀器

新版體內藥物分析第30頁

采集——代表性和同一性 —采集枕部發(fā)樣 —微量元素在前額部位頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高

洗滌—除去外源性污染物

頭發(fā)采集與洗滌新版體內藥物分析第31頁

毛發(fā)樣品制備

1．毛發(fā)中藥品提取—慣用方法：

直接用甲醇提取

酸水解(0.1mol/L鹽酸)

堿水解(1mol/L氫氧化鈉)

酶水解(

-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)2．有機破壞法

新版體內藥物分析第32頁二、生物樣品貯存與處理

冷藏—冰箱(4℃)中短期保留(1-2d)

冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)

中長久保留

冷藏或冷凍時限經(jīng)穩(wěn)定性考查后確定新版體內藥物分析第33頁生物樣品貯存

血樣

采集后及時分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存

—若不予先分離，血凝后冰凍保留，則因冰凍有時易引發(fā)細胞溶解，會妨礙血漿或血清分離 —置硬質玻璃試管中完全密塞后保留

新版體內藥物分析第34頁

尿樣

采集后應馬上測定，若不能馬上測定，加入防腐劑后保留 慣用防腐劑：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、濃鹽酸等

甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改變尿液酸堿性抑制細菌生長保留時間為24-36h(4℃)或長久(-20℃)生物樣品貯存

新版體內藥物分析第35頁

唾液

為阻止酶催化生成粘蛋白，應在4℃以下保留 —保留過程中放出二氧化碳而使pH升高，測定唾液pH時應在取樣當初為好 —冷凍保留唾液時，解凍后有必要將容器內唾液充分攪勻后再用，不然測定結果會產(chǎn)生誤差

生物樣品貯存

新版體內藥物分析第36頁

注意事項：

1．冷凍樣品測定時，需暫時解凍。解凍后樣品應一次性測定完成，不應重復凍融 2．假如采集樣品不能一次性測定，則應以小體積分裝貯存，每次按計劃取一定數(shù)量進行測定生物樣品貯存

新版體內藥物分析第37頁第二節(jié)生物樣品預處理樣品預處理技術

分離、純化、富集或化學衍生化等，為藥品最終測定創(chuàng)造良好條件

新版體內藥物分析第38頁

樣品預處理是體內藥品分析中極為主要步驟；也是分析中最困難、最繁雜工作——對于生物樣品預處理極難要求固定程序和方式，必須結合測定實際和要求，采取恰當方法和技術新版體內藥物分析第39頁一、生物樣品預處理目標

使藥品從綴合物及結合物中釋放——測定藥品總濃度

使樣品純化——消除生物基質中內源性物質干擾

提升檢測靈敏度——適應和符合測定方法要求靈敏度

預防分析儀器污染和劣化——提升分析儀器耐受程度、改進分析結果新版體內藥物分析第40頁二、生物樣品預處理與制備技術

生物樣品預處理大致分為以下五類

1．有機破壞法 2．去除蛋白法 3．溶劑萃取法 4．綴合物水解 5．化學衍生化法新版體內藥物分析第41頁（一）有機破壞法

應用——微量元素測定

方法

1．濕法破壞 2．干法破壞 3．氧瓶燃燒法新版體內藥物分析第42頁（二）去除蛋白質

非破壞性生物樣品預處理第一步可使結合型藥品釋放

1.去除蛋白后取上清液直接分析測定2.去除蛋白后取上清液經(jīng)深入分離純化、濃集后分析測定新版體內藥物分析第43頁

去除蛋白質方法

1.加入與水混溶有機溶劑—蛋白質脫水沉淀

2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質

3.加入強酸—與蛋白質陽離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀4.熱凝固法

新版體內藥物分析第44頁1.加入與水相混溶有機溶劑慣用有機溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃血樣與溶劑體積比—1∶(1-3)可除去90%以上蛋白質

乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成份損失可能性大，上清液pH為8.5~9.5甲醇—細小顆粒沉淀、不易分離；成份損失可能性小，上清液pH為8.5~9.5超速離心分離（1r/min)—離心5min新版體內藥物分析第45頁2.加入中性鹽慣用中性鹽—飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等試劑用量—血清與飽和硫酸銨百分比為1∶2時除去90%以上蛋白質 分離—高速(12000r/min)離心 上清液液性——pH7.0~7.7新版體內藥物分析第46頁3.加入強酸慣用強酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等試劑用量——血清與強酸百分比為1∶0.6時，除去90%以上蛋白質分離——高速(12000r/min)離心1~2min上清液液性——pH0~4過量三氯醋酸——煮沸分解為氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀新版體內藥物分析第47頁4.

加熱法

測定對熱穩(wěn)定性好組分時，可采取加熱方法將一些熱變性蛋白沉淀 加熱溫度視欲測組分熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜岬?0℃；蛋白沉淀后可用離心或過濾除去

優(yōu)點——方法最簡單

缺點——只能除去熱變性蛋白

新版體內藥物分析第48頁（三）分離、純化與濃集

在生物樣品制備過程中，進行選擇性分離、純化與濃集

分離—消除內源性物質、代謝物或其它共存藥品干擾

純化與濃集—提升被測藥品靈敏度

樣品經(jīng)分離、純化與濃集與測定方法相結合，到達專屬性強、靈敏度高、準確性好

新版體內藥物分析第49頁生物樣品分離、純化方法

1.液—液萃取法(傳統(tǒng)方法)

2.固相萃取法—液-固萃取法 —自動化固相萃取技術 —固相微萃取

3.超濾法

新版體內藥物分析第50頁1.液—液萃取法

（liquid-liquidextraction,LLE）大多數(shù)藥品為脂溶性，在有機溶劑中溶解度大于水中

大多數(shù)內源性雜質是強級性水溶性物質采取有機溶劑萃取法新版體內藥物分析第51頁

溶劑選擇—適當溶劑是成功主要條件了解藥品與溶劑化學結構及其性質—相同相溶標準對藥品未電離分子可溶，電離形式分子不溶沸點低、易揮散，毒性小與水不相混溶不影響紫外檢測含有較高化學穩(wěn)定性和惰性 新版體內藥物分析第52頁液-液萃取法

有機溶劑萃取次數(shù)—通常為1次，必要時2~3次有機溶劑每次用量

—與水相體積比通常為1:1或2~5:1 經(jīng)過萃取回收率確定最正確萃取次數(shù)與每次溶劑用量新版體內藥物分析第53頁由藥品pKa確定堿性藥品最正確pH值：高于pKa值1~2個pH單位酸性藥品最正確pH值：低于pKa值1~2個pH單位普通規(guī)則：堿性藥品在堿性pH值、酸性藥品在酸性pH值介質中提取

液-液萃取法水相pH值:新版體內藥物分析第54頁

生物樣品宜在堿性或近中性提取，生物基質中內源性物質多為酸性，在堿性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13緩沖液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)測定，堿性藥品在pH13下提取液雜質峰少

液-液萃取法水相pH值:新版體內藥物分析第55頁空白血清乙醚提取物HPLC色譜圖返回液-液萃取(續(xù))pH13pH7pH2新版體內藥物分析第56頁液相微萃取新版體內藥物分析第57頁

2.固相萃取法

（Solid-phaseextraction,SPE）

原理

將不一樣填料作為固定相裝入微型小柱，當含有藥品生物樣品溶液經(jīng)過時，因為受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥品或雜質被保留在固定相上，用適當溶劑清洗雜質，再用適當溶劑洗脫藥品。新版體內藥物分析第58頁慣用洗脫方式①藥品與固定相親和力比雜質強而被保留，用一個對藥品親和力更強溶劑洗脫②雜質與固定相親和力比藥品強藥品被直接洗脫

固相萃取法新版體內藥物分析第59頁固相萃取法

固相選擇標準

固相與被測組分應含有相同極性①親脂型（大孔吸附樹脂、親脂性鍵合相硅膠）②親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）③離子交換型

新版體內藥物分析第60頁

關于固相萃取小柱：a.常見固相萃取柱分為三部分：醫(yī)用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯篩板(20μm)和填料(多為40-60μm，80-100μm)。b.慣用規(guī)格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml為例：其中100mg為填料質量，1ml是空柱管體積。c.一次性使用：為防止交叉污染，確保檢測可靠性，SPE柱通常是一次性使用。新版體內藥物分析第61頁固相萃取法試驗步驟第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料第二步：用水或適當緩沖液沖洗小柱—除去殘留甲醇第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液第四步：用水或適當緩沖液沖洗小柱，去除內源性雜質第五步：選擇適當洗脫溶劑洗脫被分析物，搜集洗脫液，揮干溶劑，備用或直接進行在線分析新版體內藥物分析第62頁固相萃取法注意：

1.血漿樣品可直接上柱2.樣品量0.1-2ml3.流速1-2ml/min新版體內藥物分析第63頁固相萃取法優(yōu)點①引入雜質少②完全防止乳化形成③在優(yōu)化條件下有較高萃取率、重現(xiàn)性很好④使用溶劑大多可與水混溶，易于自動化

缺點①價格昂貴②技術要求高③批-批之間有差異新版體內藥物分析第64頁SPE與LLE及沉淀蛋白法比較SPE：高提取率及高選擇性，快速、簡單，可自動化，應用較多。LLE：兩相間分配平衡時間較長萃取回收率及選擇性隨藥品及萃取條件而改變沉淀。蛋白法：快速簡便、回收率高；待測物含量低時不適用

新版體內藥物分析第65頁自動化SPE技術

優(yōu)點

①節(jié)約時間，400個/hr，確保了較高工作效率②降低了操作誤差，提升準確度和精密度③安全性好，可防止人對有毒樣品接觸

缺點

①殘留物對測定影響②在采取連續(xù)測定時，要考慮樣品理化性質穩(wěn)定性對測定影響新版體內藥物分析第66頁2.2固相微萃取法（SPME）

SPME裝置簡單，類似于氣相色譜微量注射器，其基本裝置如圖

1．壓桿2．簡體3．壓桿卡持螺釘4．Z形槽5．簡體視窗6．調整針頭長度定位器7．拉伸彈簧8．密封隔膜9．注射針管10．熔融石英纖維11．熔融石英纖維新版體內藥物分析第67頁SPME操作方法

固相微萃取方法分為萃取過程和解吸過程兩步 ①萃取過程—含有吸附涂層萃取纖維暴露在樣品中進行萃取 ②解吸過程—將已完成萃取過程萃取器針頭插入氣相色譜進樣裝置氣化室內，使萃取纖維暴露在高溫載氣中，并使萃取物不停地被解吸下來，進入后序氣相色譜分析新版體內藥物分析第68頁SPME特點

①集采樣、萃取、濃集、進樣于一體，防止引入多步操作誤差 ②無需萃取溶劑，樣品量小、空白值小 ③萃取選擇性高 ④纖維涂層（萃取頭）可重復用上百次 ⑤適合用于分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質 ⑥與GC及HPLC、MS等聯(lián)用，自動化分析

當前SPME使用固相涂層種類限制了它應用，但該法極具前途新版體內藥物分析第69頁3.超濾法性質—以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質一個膜分離技術；特點—無需加熱；無需添加化學試劑；無相改變；無破壞性應用—游離藥品首選方法，尤其適合TDM操作—分子量截留值在5萬左右超濾膜過濾可將分子量大血漿蛋白以及結合了藥品血漿蛋白分離新版體內藥物分析第70頁（四）綴合物水解

（HydrolysisofConjugate）

綴合物

藥品或其代謝物與體內內源性物質（葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等）結合生成產(chǎn)物

測定尿液中藥品總量時需先行水解——從綴合物中釋放藥品新版體內藥物分析第71頁

綴合物水解方法 ①酸水解——使用鹽酸，該法比較簡便、快速；與酶水解相比專一性較差、有些藥品在水解中易分解 ②酶水解——專一性較強、藥品無分解；時間長、費用大，異性蛋白對于迂酸及受熱不穩(wěn)定藥品，能夠采取酶水解法

新版體內藥物分析第72頁

酶水解慣用酶：

葡糖苷酸酶（Glucuronidase）

硫酸酯酶（Sulfatase）

最慣用是葡萄糖苷酸酶與硫酸酯酶混合酶

水解條件：

溶液pH值4.5~5.5，溫度37℃培育數(shù)小時

綴合物水解方法新版體內藥物分析第73頁

加入適量酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，過濾或離心，取上清液供萃取用

最慣用酶—蛋白水解酶中枯草菌溶素可在較寬pH范圍(pH7.0~11.0)內使蛋白肽鍵降解，在50~60℃含有最大活力

新版體內藥物分析第74頁

③溶劑解

綴合物（主要是硫酸酯）在萃取過程中可被加入溶劑分解稱作溶劑解尿中甾體硫酸脂在pH1時加醋酸乙酯提取，產(chǎn)生溶劑解

當前對綴合物分析，逐步趨向于直接測定綴合物含量，體內以綴合物形式存在藥品量，排出體外時，綴合物占全部排出藥品總量比率

新版體內藥物分析第75頁例：血、尿中三唑侖代謝物GC測定

酸水解：

尿中綴合物用鹽酸水解時，使代謝物七元環(huán)斷裂、形成對應二苯甲酮衍生物

酶水解：

用

-葡萄糖醛酸苷酶水解酶，尿液1ml、pH4.8緩沖液50

l、

-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1ml、37℃水浴水解12h，水解后尿樣調成pH9乙醚萃取新版體內藥物分析第76頁（五）化學衍生化

藥品分子中含有活潑H者均可被化學衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、