第三章-固定化酶反課件

3.1酶的固定化背景酶的固定化方法影響固定化酶活力的因素固定化對酶動力學(xué)特征的影響3.1酶的固定化背景13.1.1背景游離酶參與反應(yīng)的缺點(diǎn)：1）穩(wěn)定性差、液相中含量少，2）反應(yīng)結(jié)束后不易回收、3）酶、底物和產(chǎn)物處于同一相，對產(chǎn)物分離不利固定化酶：即水不溶性酶，是通過物理的或化學(xué)的方法，將溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運(yùn)動受到完全約束，或受到局部約束的一種不溶于水但仍具有催化活性的酶，它能以固相狀態(tài)作用于底物進(jìn)行催化反應(yīng)其優(yōu)點(diǎn)：可以長期保留在反應(yīng)器內(nèi)反復(fù)使用，易實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)；反應(yīng)結(jié)束后易與產(chǎn)物分離，簡化了產(chǎn)物分離工藝，其大多數(shù)固定化酶穩(wěn)定性也比游離酶好缺點(diǎn)：活力會下降，反應(yīng)易受傳質(zhì)速率的控制，對大分子底物、產(chǎn)物不適用研究歷史：1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)酵母蔗糖酶能被吸附到骨碳粉末上，并在吸附狀態(tài)下具有催化活性；以后以色列科學(xué)家對酶的固定化方法、固定化的理化性質(zhì)等進(jìn)行了開創(chuàng)性的研究，1969年日本的千葉一郎將固定化氨基酸酰化酶應(yīng)用于DL－氨基酸的拆分上，1971年國際酶工程會議給出了固定化酶的定義。3.1.1背景游離酶參與反應(yīng)的缺點(diǎn)：1）穩(wěn)定性差、液相中含23.1.2酶的固定化方法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理結(jié)合法離子結(jié)合法共價結(jié)合法凝膠包埋微膠囊包埋纖維素包埋3.1.2酶的固定化方法載體結(jié)合法物理結(jié)合法離子結(jié)合法共3影響固定化酶催化活力的因素構(gòu)象效應(yīng)：由于載體與酶之產(chǎn)的共價鍵作用，引起酶的活性部位發(fā)生扭曲變形，改變了酶活性部位的三維空間結(jié)構(gòu)，減弱了酶與底物的結(jié)合力，導(dǎo)致酶的活性下降。位阻效應(yīng)：由于載體選擇不當(dāng)或載體空隙太小，致使酶的活性部位不易與底物結(jié)合，對酶的活性部位造成了空間障礙。分配效應(yīng)：由于固定化酶載體的親水性、疏水性及靜電作用等，使得底物和產(chǎn)物及其效應(yīng)物在微環(huán)境和宏觀環(huán)境中濃度不同的現(xiàn)象。擴(kuò)散效應(yīng)：底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物的遷移和運(yùn)轉(zhuǎn)速率受到限制的一種效應(yīng)。影響固定化酶催化活力的因素構(gòu)象效應(yīng)：由于載體與酶之產(chǎn)的共價鍵4酶的固定化對其動力學(xué)特征的影響原因：由于酶的活性中心的氨基酸殘基的空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)發(fā)生了變化，或者固定化酶的周圍形成了能對底物傳遞產(chǎn)生影響的擴(kuò)散層或靜電的相互作用等。對底物專一性的改變穩(wěn)定性的改變最適pH值和溫度的改變米氏常數(shù)的改變酶的固定化對其動力學(xué)特征的影響原因：由于酶的活性中心的氨基酸53.2外擴(kuò)散的限制作用特點(diǎn)液固相間的傳質(zhì)速率外擴(kuò)散的限制作用外擴(kuò)散有效因子3.2外擴(kuò)散的限制作用特點(diǎn)63.2.1外擴(kuò)散的特點(diǎn)酶促反應(yīng)過程與傳質(zhì)過程是各自獨(dú)立的底物先從液相主體擴(kuò)散到固定化酶的外表面發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)物從固定化酶的外表面擴(kuò)散進(jìn)入液相主體3.2.1外擴(kuò)散的特點(diǎn)酶促反應(yīng)過程與傳質(zhì)過程是各自獨(dú)立的73.2.2液固相間的傳質(zhì)速率由于攪拌，反應(yīng)體系中的液相主體的底物濃度處處相同，假定為S0，底物在顆粒表面因反應(yīng)而消耗，同時由于液體的粘性，在固液表面附近產(chǎn)生一個滯流層，而固體表面液體流速率為0，因而在滯流層產(chǎn)生濃度梯度，進(jìn)而導(dǎo)致物質(zhì)的傳遞，且傳質(zhì)阻力全部集中在滯流層。根據(jù)Fick第一定律，得液固相間的傳質(zhì)速率為其中Ds為底物在液相中的分子擴(kuò)散系數(shù)，m2/sa為固定化酶的比表面積，m-1

S0SiRR+δ3.2.2液固相間的傳質(zhì)速率由于攪拌，反應(yīng)體系中的液相主體83.2.3外擴(kuò)散的限制作用固定化酶外表面的反應(yīng)速率可表示為當(dāng)化學(xué)反應(yīng)速率和傳質(zhì)速率相差不大時，體系在穩(wěn)態(tài)條件下，有下式成立，傳質(zhì)速率＝化學(xué)反應(yīng)速率，即：求解此方程，得出無因次化處理，令3.2.3外擴(kuò)散的限制作用固定化酶外表面的反應(yīng)速率可表示為9解之得：，當(dāng)B>0時取+號；當(dāng)B<0時，取-號，其中。這里，Da準(zhǔn)數(shù)是對反應(yīng)控制步驟時行描述的一個重要的無因次數(shù)群，其物理意義為，因此當(dāng)Da>>1（50）時，此時固定化酶反應(yīng)的控制步驟為傳質(zhì)，此時Si=0,RSi=KLaS0，反之，當(dāng)Da<<1(0.1)，此時固定化酶反應(yīng)的控制步驟為動力學(xué)（化學(xué)反應(yīng)速率），即Si=S0，，稱為最大本征反應(yīng)速率。解之得：103.2.4外擴(kuò)散有效因子，根據(jù)此定義式知：因此可以根據(jù)判斷外擴(kuò)散的影響。因此在利用固定化酶進(jìn)行反應(yīng)時，總是希望盡可能接近1，此時應(yīng)控制反應(yīng)條件，使Da準(zhǔn)數(shù)盡可能地小，由知，可以通過降低固定化酶顆粒的粒徑，提高液體的流速及適當(dāng)增加液相主體的底物濃度來使Da減小。3.2.4外擴(kuò)散有效因子11的關(guān)系由圖中可以看出：當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾佣鳧a不變時，隨著底物濃度的增加，增加，即增加底物濃度，可以克服外擴(kuò)散的影響，當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔儠r，Da增加，減少，且當(dāng)Da<0.1時，接近1。的關(guān)系由圖中可以看出：12可觀測丹克萊爾準(zhǔn)數(shù)（）令，當(dāng)傳質(zhì)速率和反應(yīng)速率相差不大時，在穩(wěn)定狀態(tài)下有下式成立，，因此得到，從此式中可以看出：當(dāng)時，，外擴(kuò)散影響可忽略，當(dāng)時，，外擴(kuò)散影響明顯。怎樣識別外擴(kuò)散的影響？可觀測丹克萊爾準(zhǔn)數(shù)（）令133.3內(nèi)擴(kuò)散的限制作用特點(diǎn)液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散速率微孔內(nèi)反應(yīng)與擴(kuò)散的關(guān)系式內(nèi)擴(kuò)散有效因子表觀泰勒模數(shù)3.3內(nèi)擴(kuò)散的限制作用特點(diǎn)143.3.1內(nèi)擴(kuò)散的特點(diǎn)對于多孔的固定化酶顆?；蚰?，具有催化作用的部位基本上是在微孔的內(nèi)表面，因此擴(kuò)散過程和反應(yīng)過程是同時發(fā)生的。在微孔內(nèi)，由于內(nèi)擴(kuò)散阻力的存在，反應(yīng)組分在微孔內(nèi)的濃度分布是不均勻的，對于底物，其濃度在固定化酶外表面處最高，在顆?；蚰ぶ行奶幾畹停纬闪擞杀砑袄餄舛戎饾u降低的分布，由于反應(yīng)和擴(kuò)散同時進(jìn)行，所以沿微孔方向，反應(yīng)速率也在下降，在顆粒中心處，反應(yīng)速率最低。擴(kuò)散過程與微孔結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。3.3.1內(nèi)擴(kuò)散的特點(diǎn)對于多孔的固定化酶顆粒或膜，具有催化153.3.2液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散液體在單一圓柱形微孔內(nèi)的分子擴(kuò)散速率可用Fick第一定律來表示：

其中Ds為底物在液相中的分子擴(kuò)散系數(shù)，一般在1×10－9m2/sz為沿擴(kuò)散方向的距離，mNs為底物在單位時間內(nèi)通過單位截面積微孔的量，moL/(m2s)但固定化酶顆?；蚰さ奈⒖资欠菆A柱形的，底物在微孔內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)要比在液相主體中小得多，工程上采用有效分子擴(kuò)散系數(shù)來表示。擴(kuò)散中發(fā)生在微孔內(nèi)，且微孔面積與顆粒外表面積之比等于孔隙率微孔的形狀是彎曲的，因此引入曲節(jié)因子，故在有效分子擴(kuò)散系數(shù)可表示為3.3.2液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散液體在單一圓柱形微孔內(nèi)的分子擴(kuò)163.3.3微孔內(nèi)擴(kuò)散與反應(yīng)的關(guān)系式球狀固定化酶片狀固定化基本假設(shè)模型的建立顆粒內(nèi)底物濃度與擴(kuò)散阻力的關(guān)系3.3.3微孔內(nèi)擴(kuò)散與反應(yīng)的關(guān)系式基本假設(shè)模型的建立顆粒內(nèi)173.3.3.1球狀固定化酶之基本假設(shè)固定化酶顆粒是等溫的顆粒內(nèi)傳質(zhì)為擴(kuò)散，且服從Fick第一定律，Des不隨位置而變化顆粒是均勻的，不僅其活性分布均勻，性質(zhì)也均勻底物與產(chǎn)物分配系數(shù)為1，固定化酶活性穩(wěn)定反應(yīng)為單底物限制，底物與產(chǎn)物的濃度僅沿半徑方向變化3.3.3.1球狀固定化酶之基本假設(shè)固定化酶顆粒是等溫的18球狀固定化酶之模型的建立假定球狀固定化酶的半徑為R，在距球中心為r處取一殼層，其厚度為dr，底物通過微孔由外向內(nèi)擴(kuò)散，且通過此殼層，底物在（r+dr）處擴(kuò)散進(jìn)入，在r處離開，并在殼層內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)而消耗底物，以擴(kuò)散方面為正方向，則單位時間內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)入微元?dú)拥牡孜锏牧繛閱挝粫r間內(nèi)由擴(kuò)散離開微元?dú)拥牡孜锏牧繛椋簡挝粫r間內(nèi)微元?dú)觾?nèi)的底物的反應(yīng)量為在穩(wěn)態(tài)條件下，沿擴(kuò)散方向，底物的物料衡算式可表示為流入量－流出量＝反應(yīng)量，即：rr+dr擴(kuò)散方向球狀固定化酶之模型的建立假定球狀固定化酶的半徑為R，在距球中19上式可變?yōu)?，重排后得兩邊同除以r2dr，得即上式變?yōu)?/p>

上式可變?yōu)?0球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之一雙曲函數(shù)，首先要進(jìn)行無因次化處理：令

對于球形固定化酶，，則有

球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之一雙曲函數(shù)21整理：即：，利用邊界條件求解：該方程無解析解，只有數(shù)值解（數(shù)值計算法是研究數(shù)學(xué)問題的一類近似解法，即從一組原始數(shù)據(jù)，按照某種確定的運(yùn)算規(guī)則，進(jìn)行有限步運(yùn)算，最終獲得數(shù)學(xué)問題數(shù)值形式的滿足某種精度要求的近似解，如龍格庫塔法，近似解也可做成圖）整理：22底物濃度沿半徑分布圖從右圖可以看出，對同一位置r處，隨著Φ的增加，底物濃度在減少。Ф的大小，表征了內(nèi)擴(kuò)散阻力的大小，因此隨內(nèi)擴(kuò)散阻力的增大，同一位置處底物濃度減小，而且當(dāng)Ф不變時，愈往顆粒內(nèi)部，底物濃度越小。當(dāng)內(nèi)擴(kuò)散阻力較小時，Ф＝0.2,1,底物可以到過顆粒中心處，但當(dāng)內(nèi)擴(kuò)散阻力較大時，Ф=5,10,底物還未達(dá)到顆粒中心處就反應(yīng)掉了。圖底物濃度沿半徑分布圖從右圖可以看出，對同一位置r處，隨著Φ的23球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之二當(dāng)，同樣對進(jìn)行無因次化處理，得，同樣給定邊界條件進(jìn)行求解，得球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之二當(dāng)24球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之三當(dāng)對于零級反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)速率與底物濃度無關(guān)，但要發(fā)生反應(yīng)，必須有底物存在，同樣給定邊界條件對其進(jìn)行求解，得當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，使固定化酶顆粒中心處底物濃度恰好為0的顆粒半徑，稱為臨界半徑，球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關(guān)系之三當(dāng)253.3.3.2片狀固定化酶假定酶膜的厚度為2L，但厚度與其長度與寬度相比要小得多，因此底物的擴(kuò)散只考慮與兩個大的側(cè)面相垂直方向上的擴(kuò)散，而忽略其他四個側(cè)面的擴(kuò)散，同樣取一厚度為dl的微元體，做底物的物料衡算：假定酶膜的面積為A，則單位時間進(jìn)入微元體底物量表示為單位時間流出微元體的底物量為

單位時間內(nèi)微元體內(nèi)反應(yīng)的底物量為擴(kuò)散方向3.3.3.2片狀固定化酶假定酶膜的厚度為2L，但厚度與其26對底物進(jìn)行物料衡算：流入－流出＝反應(yīng)消耗同樣，底物沿擴(kuò)散方向的濃度分布與rs的形式有關(guān)，當(dāng)酶膜完全浸在反應(yīng)液中時，若，同樣進(jìn)行無因次化處理，令

則上式變?yōu)?，同樣給定邊界條件：同樣此方程只有數(shù)值解，沒有解析解。對底物進(jìn)行物料衡算：流入－流出＝反應(yīng)消耗27當(dāng)，無因次化處理得，解得

當(dāng)

同樣也存在臨界厚度的問題：當(dāng)283.3.4內(nèi)擴(kuò)散有效因子內(nèi)擴(kuò)散有效因子的定義一級反應(yīng)動力學(xué)表達(dá)式有效因子的一般表達(dá)式零級反應(yīng)表達(dá)式3.3.4內(nèi)擴(kuò)散有效因子內(nèi)擴(kuò)散有效因子的定義293.3.4.1有效因子的定義定義：在穩(wěn)態(tài)條件下，RS應(yīng)等于從顆粒外表面處向微孔擴(kuò)散的速率，即當(dāng)無外擴(kuò)散影響時，，對于球狀固定化酶，3.3.4.1有效因子的定義定義：303.3.4.2一級反應(yīng)當(dāng)，

即而對于片狀固定化酶3.3.4.2一級反應(yīng)當(dāng)31固定化酶形狀對有效因子的影響隨著的增加，下降，當(dāng)，為動力學(xué)控制區(qū)，說明內(nèi)擴(kuò)散阻力很小，但當(dāng)>3時，內(nèi)擴(kuò)散阻力明顯，內(nèi)擴(kuò)散成為控制步聚，此時，為過渡區(qū)。此外，固定化酶幾何形狀不同，對關(guān)系影響不大，特別是在較小或較大時。固定化酶形狀對有效因子的影響隨著的增加，323.3.4.3有效因子的一般形式當(dāng)對于球狀固定化酶，進(jìn)行無因次化處理，則因?yàn)镾~r之間無解析解，因此亦無解析解，因而

3.3.4.3有效因子的一般形式當(dāng)33由此可看出，當(dāng)增加時，下降，而，從中可以看出影響泰勒模數(shù)的因素：1）顆粒大小或厚度，即，對的影響明顯，又稱為特征尺寸，越大，值越大，越小，因此為了減少內(nèi)擴(kuò)散的影響的限制，反應(yīng)中應(yīng)盡可能采用小顆粒。2）顆?；钚裕磩恿W(xué)參數(shù)3）有效分子擴(kuò)散系數(shù)由此可看出，當(dāng)增加時，下降，而343.3.4.4零級反應(yīng)動力學(xué)對于零級反應(yīng)動力學(xué)，只要整個球形固定化酶顆粒內(nèi)部有底物存在，反應(yīng)就可以進(jìn)行，此時，若由于內(nèi)擴(kuò)散的影響，使得底物在固定化酶顆粒某一位置r處濃度為0，則定義一個零級反應(yīng)的泰勒模數(shù)，來計算零級反應(yīng)的有效因子，定義：對于球形固定化酶，

3.3.4.4零級反應(yīng)動力學(xué)對于零級反應(yīng)動力學(xué)，只要整個球353.3.5表觀泰勒模數(shù)定義：，對于球形固定化酶，由得當(dāng)3.3.5表觀泰勒模數(shù)定義：363.4擴(kuò)散影響下的假象擴(kuò)散影響的判定擴(kuò)散對反應(yīng)級數(shù)的影響擴(kuò)散對活化能的影響擴(kuò)散對固定化酶穩(wěn)定性的影響3.4擴(kuò)散影響下的假象擴(kuò)散影響的判定373.4.1擴(kuò)散影響的判定直接法：如果在相同的反應(yīng)條件下，只改變底物的流速，如果流速改變，底物的轉(zhuǎn)化率也隨之改變，說明存在外擴(kuò)散的影響，繼續(xù)提高流速，轉(zhuǎn)化率不再改變，說明消除了外擴(kuò)散的影響，在此基礎(chǔ)上，維持相同的反應(yīng)條件，只減少固定化酶的特征尺寸，隨著特征尺寸的減少，，底物的轉(zhuǎn)化率增加，說明存在內(nèi)擴(kuò)散的影響，繼續(xù)減少特征尺寸，直到底物的轉(zhuǎn)化率不變，說明內(nèi)擴(kuò)散的影響消除。圖解法：