淺談組培苗的脫毒及應(yīng)用

植物在生長過程中幾乎都會受到病毒的侵染，尤其是無性繁殖的植物，病毒嚴(yán)重影響果樹、蔬菜、花卉和樹木等植物的生長發(fā)育，造成產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，嚴(yán)重時甚至造成植物的死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，全世界每年因病毒造成的經(jīng)濟損失中，糧食作物達200億美元，經(jīng)濟作物達600億美元[1]。第九次國際病毒委員會公布的病毒數(shù)量達到了2000多種，歸屬于6個目87個科19個亞科349個屬。1植物病毒的傳播方式及為害病毒的傳播途徑多種多種，如昆蟲傳播、土壤傳播、機械傳播、無性繁殖材料傳播，甚至有些病毒可以通過種子傳播。植物感染病毒之后主要表現(xiàn)為內(nèi)部癥狀和外部癥狀2個方面：內(nèi)部癥狀主要有組織病變壞死、莖部微管組織和葉部壞死、產(chǎn)生激素、引起組織增生或產(chǎn)生各種類型的內(nèi)含體，植物正常的生理代謝受到干擾，葉綠素、花青素及激素等的產(chǎn)生受到改變；外部癥狀主要有變色、壞死、畸形等相應(yīng)的異常癥狀。植物感染病毒造成的經(jīng)濟損失是比較大的，如葡萄的扇葉病毒可使葡萄每年減產(chǎn)10%～15%，非洲可可樹的腫枝病可使產(chǎn)量減少50%以上，馬鈴薯的退化病毒可使產(chǎn)量減少50%～70%。對于觀賞性的植物，病毒導(dǎo)致花朵變少變小，甚至畸形、變色，從而失去觀賞價值。2植物脫毒的方式2.1莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒1952年Morel等從感染花葉病毒和斑萎病毒的大麗花植株上切取莖尖分生組織進行培養(yǎng)，并獲得脫毒苗。莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒苗是利用了病毒在植物體內(nèi)分布不均勻的特點，病毒主要通過微管組織進行轉(zhuǎn)移，而莖尖不含有微管系統(tǒng)，莖尖中的葉原基能分泌生長素抑制病毒的增殖，所以莖尖幾乎不含有病毒或病毒的濃度很低，通過剝離莖尖或根尖進行培養(yǎng)，可獲得脫毒苗。剝?nèi)デo尖的大小是脫毒的關(guān)鍵，一般剝?nèi)?.1～1mm莖尖進行培養(yǎng)，莖尖太小難于成活，莖尖太大脫毒效果差。何新民等[2]對“紅姑娘2號”甘薯進行培養(yǎng)和脫毒研究，結(jié)果表明，剝?nèi)デo尖0.3～0.5mm時，脫毒率為100%，當(dāng)剝?nèi)デo尖0.6～0.8mm時，脫毒率為93.3%。因此，進行莖尖培養(yǎng)脫毒時，需要綜合考慮，選取的莖尖既要達到脫毒的效果，又要能夠獲得無病毒植株，一般選取0.2～0.5mm、帶有1～2個葉原基的莖尖進行培養(yǎng)。2.2熱處理脫毒熱處理脫毒又稱為溫?zé)岑煼?，主要利用病毒和寄主對高熱忍耐的差異，將植物材料置于高于正常溫度的條件下，可使材料內(nèi)部的病毒部分或全部鈍化，而植物材料不受或很少受到傷害，從而脫除病毒。在熱處理時，重要的影響因素是處理的溫度和時間，在一般情況下，熱處理的溫度越高，時間越長，脫毒效果越好，但是植株成活率就越低。張慧華等[3]對東方百合綜合脫毒技術(shù)的研究表明，隨著熱處理時間的增加，莖尖萌發(fā)率降低，愈傷組織的分化降低，處理20d后成活率明顯下降，30d后莖尖基本死亡。不同植物、不同品種、不同病毒種類對高溫的忍耐力是不一樣的，如百合籽球于35℃左右溫度下處理4周，可明顯降低病毒含量[4]，劉衛(wèi)平等[5]對帶有X病毒和Y病毒的馬鈴薯品種“大西洋”采用35℃4h+31℃4h進行交替培養(yǎng)，脫除PVX的比例達到60.6%。但熱處理存在脫毒時間長、脫毒不徹底、脫毒具有一定的局限性，一般只能脫除球狀病毒和類菌質(zhì)體等缺點。2.3熱處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒熱處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒主要是先將植物材料采用熱處理的方法進行脫毒，然后再切取較大的莖尖進行培養(yǎng)；也可以先切取莖尖進行培養(yǎng)，然后再對試管苗進行熱處理。該種脫毒方法既可縮短熱處理的時間，提高植株的成活率，又可剝離較大的莖尖，提高脫毒效果。如1956年Thomson將感染X病毒、Y病毒的馬鈴薯放在暗處進行培養(yǎng)，用35℃處理7～28d，切取5mm的莖尖進行培養(yǎng)，獲得了脫毒苗。宋瑞林等[6]采用這種方法脫除了切花菊中攜帶的番茄不育病毒。2.4微體嫁接脫毒微體嫁接脫毒是將嫁接技術(shù)和植物組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的一種獲得脫毒苗的方法，該方法主要用于木本植物。具體操作是在無菌條件下將0.1～0.2mm的莖尖分生組織作為接穗，嫁接到由組培方式獲得的無菌砧木上，從而獲得完整植株[7]。這種脫毒方法大大縮短了育苗周期，保持了木本的優(yōu)良性狀。目前這一脫毒方式在杏、蘋果、柑橘、桉樹、山茶等植物的脫毒中已獲得成功。2.5愈傷組織培養(yǎng)脫毒愈傷組織脫毒的原理是誘導(dǎo)形成的愈傷組織細胞有些不帶病毒，這是由于病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，病毒的復(fù)制速度趕不上細胞增殖的速度，或者在誘導(dǎo)和增殖愈傷組織過程中，細胞發(fā)生了變異，產(chǎn)生了抗體。劉文萍等[8]通過唐菖蒲的花蕾誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)脫除了TMV病毒，且脫毒率達到60%。目前通過這種方法獲得脫毒苗已在馬鈴薯、大蒜、草莓、枸杞、唐菖蒲、老鸛草等植物中獲得了成功[9]。3脫毒苗的檢測通過上述脫毒方法獲得的脫毒苗有沒有脫除病毒，必須通過鑒定才能確定。最初人們主要采用觀察法和指示植物法來判斷植物是否脫除病毒，最近幾十年人們一直在探索更加簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測方法，以滿足科研、教研的需求。3.1直接觀察法觀察脫毒苗的生長情況，如果出現(xiàn)花葉、黃花、畸形、矮化叢生等典型癥狀，說明植株沒有脫除病毒。如果苗子生長整齊一致，長勢好，葉色濃綠，說明苗木不帶木病毒。該種方法一般需要和其他檢測方法結(jié)合起來，才能更好地檢測植株是否攜帶病毒。3.2指示植物法1929年美國的植物病理學(xué)家Holmes發(fā)現(xiàn)，用感染TMV煙葉汁液與金剛砂混合，涂抹到健康的煙葉上，2～3d后煙葉上出現(xiàn)了壞死斑。由于病毒具有一定的專寄性，所以這種鑒定方法應(yīng)根據(jù)不同的病毒選擇合適的指示植物。同時這種鑒定方法也有一定的局限性，不能測定出病毒的濃度，只能測出相對感染力。3.3抗血清鑒定法該種方法主要利用含有病毒抗體的血清與植物病毒發(fā)生的血清反應(yīng)。不同的病毒會產(chǎn)生特異性不同的抗血清，用特定病毒的抗血清鑒定病毒的種類，具有特異性強、檢測速度快的優(yōu)點，所以，抗血清鑒定法是鑒定植物病毒的有效方法之一。但是該種方法需要提前制備抗原，包括病葉的研磨、過濾、澄清和純化等，以獲取較高純度的毒源；還需要制備相應(yīng)的抗血清，包括動物的選擇、飼養(yǎng)；并將相應(yīng)的毒源注射到動物體內(nèi)，一般分4～6次進行注射，最后一次注射10～14d后，采集血樣，分離出相應(yīng)的抗血清，與甘油等比例混合后放于-20℃低溫條件下保存。由于目前還有很多植物病毒的抗血清沒有制備出來，因此抗血清鑒定法有很大的局限性。3.4PCR檢測技術(shù)PCR檢測技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測技術(shù)，是美國科學(xué)家Saiki和Mullis等在1985年創(chuàng)建的一種選擇性體外擴增DNA和RNA技術(shù)。自1990年有報道采用PCR檢測翠菊黃花病類菌原體之后?，F(xiàn)在很多植物中病毒的檢測也采用此種方法，如韓帥等[8]采用RT-PCR技術(shù)檢測從汶川采集到的辣椒樣本，結(jié)果顯示樣品果皮、部分種子及葉片受到TSWV和PMMoV感染。PCR檢測技術(shù)的優(yōu)點是能將微量的病毒快速擴增到可檢測的數(shù)量，在病毒濃度很低或樣品量很少的情況下，可采用該方法進行檢測，同時該方法檢測速度快、靈敏度高。但是PCR檢測技術(shù)對模板的要求較高，在檢測過程中會出現(xiàn)假陰性。3.5核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的新技術(shù)，廣泛用于生命學(xué)科中，近年來核酸雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用到病毒、類病毒的檢測、鑒定和分類中。核酸雜交技術(shù)是指具有同源性的2條核酸單鏈在一定的溫度和等離子強度等條件下，經(jīng)堿基互補配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程。將一段人工合成的核酸單鏈以非放射性同位素如生物素、熒光素等加以標(biāo)記制成探針，探針與待測樣品進行雜交，經(jīng)自顯影后指示病毒的存在及濃度含量的高低。現(xiàn)在國內(nèi)外已制備出很多植物病毒和類病毒的互補DNA探針，作為商品銷售。我國利用這一技術(shù)對葡萄扇葉病毒和柑橘裂皮病毒進行研究，取得了重大的成就。3.6電子顯微鏡法電子顯微鏡可以直接觀察植物體內(nèi)是否存在病原菌，從而確定植物是否脫毒完全。同時電子顯微鏡也能直接觀察到病毒生物大分子的亞基單位，了解病毒的大小、形狀、結(jié)構(gòu)及特征，并根據(jù)這些特征判斷病毒屬于哪種類型。如古訓(xùn)聰?shù)萚9]對海南黃燈籠辣椒種傳病毒采用電子顯微鏡負染法進行檢測，結(jié)果表明CMV能通過種子傳播。謝禮等[10]選取蠶豆病葉做成超薄切片，用電子顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蠶豆葉肉產(chǎn)生嚴(yán)重的病理變化、細胞線粒體增生、體積增大、性狀畸形。觀察法的優(yōu)點是操作簡單、省時，大多數(shù)病毒可通過制玻片進行觀察；缺點是電子顯微鏡的價格昂貴，電子穿透能力低，操作技術(shù)不易掌握，如需要病毒濃度含量較高的組織，制備超薄切片技術(shù)難度高。4脫毒苗的保存與繁殖4.1脫毒苗的保存脫毒苗脫除了病毒，但其抗病性并沒有增加，在自然條件下還容易受到病毒的侵染，因此要做好脫毒苗的保存。4.1.1隔離保存。植物病毒傳播的途徑主要是昆蟲，據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)在大概有460多種昆蟲能傳播病毒，因此脫毒苗一般需要在隔離地種植保存，以防止再次感染。隔離網(wǎng)以35～60目的尼龍網(wǎng)為好，可防止蚜蟲飛入。土壤要定期消毒，最好是沒有種過該種植物。隔離地環(huán)境要保持清潔，定期噴灑殺蟲劑，定期檢測苗木，一旦發(fā)現(xiàn)染病植株，采取果斷措施清除，避免病毒再次傳播。4.1.2離體保存。除了隔離保存，還可以采用離體保存，離體保存是將脫毒苗保存在1～9℃低溫、低光照條件下培養(yǎng)，在這樣的環(huán)境條件下脫毒苗生長緩慢，繼代周期可達半年至一年，甚至更長時間。這種保存方法成本低，保存時間長。4.2脫毒苗的繁殖經(jīng)檢測，不含病毒的苗子除了要保存還要進行無病毒苗的擴大繁殖，以滿足生產(chǎn)上的需求。田間繁殖脫毒苗主要是將脫毒苗在防蟲網(wǎng)室內(nèi)進行繁殖成原種苗，原種苗再進一步擴大繁殖成良種，供生產(chǎn)上使用。脫毒苗在繁殖過程中要防止再次感染病毒傳入，在移栽前，所使用的基質(zhì)要進行消毒，防止土傳病害，用于繁殖的所有器具、設(shè)施都要經(jīng)過消毒才能使用，灌溉用的水要達到標(biāo)準(zhǔn)，一旦發(fā)現(xiàn)有病株或弱株，要及時拔除，以免病毒傳播。5展望植物病毒是制約農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量發(fā)展的主要因素之一，植物一旦感染了病毒，就沒有化學(xué)藥劑能夠治愈，目前主要通過植物脫毒的方法獲得脫毒苗。植物脫毒的方法有很多種，各有優(yōu)缺點。植物脫毒效果的好壞不僅與植物脫毒的方法有關(guān)，還與病毒的種類、