促紅細胞生成素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及遷移能力的影響

促紅細胞生成素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及遷移能力的影響

骨髓間充質(zhì)干細胞（bmsc）是當(dāng)前的主要研究對象之一。促紅細胞生成素（erythropoietin,EPO）可通過EPO受體促進骨髓中紅細胞的生成，在臨床上廣泛應(yīng)用于各種貧血的治療。研究證實EPO具有部分非造血功能，其受體在腎臟細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞廣泛表達，表明EPO還可以起到廣泛的器官保護作用1材料和方法1.1mtt和mtt試劑Sprague-Dawley(SD）大鼠BMSC購自中國賽業(yè)生物公司，EPO購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司。四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyltetrazolium,MTT）試劑盒購自美國Sigma公司，CXC趨化因子受體（CXCchemokinereceptor,CXCR)4購自美國Abcam公司。CXCR4蛋白的一抗為兔多克隆抗體，β-actin的一抗為兔單克隆抗體，二抗均為山羊抗兔多克隆抗體。1.2細胞培養(yǎng)和群體培養(yǎng)將BMSC接種到培養(yǎng)皿中，加入足量完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO1.3學(xué)習(xí)方法1.3.1光密度的測定5組BMSC培養(yǎng)24h和48h后分別接種于6孔板中，每孔中加入20μLMTT溶液孵育4h，測定各孔的光密度（opticaldensity,OD）值。1.3.3cxcr4蛋白表達量的檢測將5組BMSC培養(yǎng)48h后接種于6孔板中，采用蛋白免疫印跡（Westernblot）檢測各組BMSC中CXCR4蛋白的表達情況。因CXCR4與β-actin蛋白分子量接近，本研究采取先孵育CXCR4蛋白，洗脫之后再孵育β-actin的方法。1.3.5油紅o染色及蘇葉染色法EPO-BMSC組和BMSC組BMSC培養(yǎng)48h后，添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行成脂分化，分化12d，待脂滴形成后進行油紅O染色，蘇木素染液浸染1min，倒置顯微鏡下觀察拍照；添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行成骨分化，分化15d，待礦化結(jié)節(jié)形成后，進行硝酸銀染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。1.4統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組bmsc的增殖率培養(yǎng)24h和48h后，EPO對BMSC增殖率的影響見圖1。培養(yǎng)24h后，對照組與10、100和500IU/mLEPO組間BMSC的增殖率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P>0.05）。培養(yǎng)48h后，與對照組比較，100IU/mL和500IU/mLEPO組BMSC的增殖率均提高（均為P<0.05）；與100IU/mLEPO組比較，500IU/mLEPO組BMSC的增殖率更高（P<0.05）。與對照組比較，1000IU/mLEPO組培養(yǎng)24h和48h后BMSC增殖率均降低（均為P<0.05）。2.2對圖結(jié)構(gòu)影響圖的影響培養(yǎng)48h后，EPO對BMSC遷移能力的影響見圖2。與對照組比較，100IU/mL和500IU/mLEPO組劃痕的距離明顯被修復(fù)，提示BMSC的遷移能力增強。2.3mcs-pcr4蛋白表達量培養(yǎng)48h后，EPO對BMSC中CXCR4蛋白表達的影響見圖3。與對照組比較，100IU/mL和500IU/mLEPO組中BMSC的CXCR4蛋白表達量升高，1000IU/mLEPO組BMSC中CXCR4蛋白表達量降低（均為P<0.05）。與100IU/mLEPO組比較，500IU/mLEPO組BMSC中CXCR4蛋白表達量更高（P<0.05）。2.4cd29和cd45培養(yǎng)48h后，EPO對BMSC表面標(biāo)志物表達情況的影響見圖4。結(jié)果顯示BMSC組和EPO-BMSC組BMSC均高表達CD90和CD44，不表達CD45。表明EPO不會影響B(tài)MSC表面標(biāo)志物的表達。2.5bmsc的分離純化EPO對BMSC定向分化的影響見圖5。BMSC組和EPO-BMSC組BMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)15d后，均可見紅色的礦化結(jié)節(jié)；經(jīng)成脂誘導(dǎo)12d后，細胞中均出現(xiàn)較為明顯的圓形小脂滴，經(jīng)油紅O染色，可見紅色脂滴。表明EPO不會影響B(tài)MSC的定向分化。2.6細胞骨架的變化培養(yǎng)48h后，EPO對BMSC細胞骨架形態(tài)的影響見圖6。BMSC組中，大多數(shù)細胞的細胞骨架雜亂排列，無固定模式；但在EPO-BMSC組，大多數(shù)細胞的纖維骨架沿細胞的長軸排列，呈平行狀。3epo的臨床應(yīng)用在不同的培養(yǎng)條件下，BMSC能夠高度增殖，并且通過誘導(dǎo)可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織細胞越來越多的研究證實了BMSC移植治療各種疾病的安全性、可行性和有效性。國內(nèi)已經(jīng)有學(xué)者在腎移植手術(shù)過程中經(jīng)移植腎動脈輸注BMSC，手術(shù)順利，術(shù)后未發(fā)生栓塞、感染等并發(fā)癥，并且受者術(shù)后均采用低劑量免疫抑制方案，也未發(fā)生排斥反應(yīng)，術(shù)后移植腎功能恢復(fù)良好綜上所述，EPO可提高BMSC的遷移率、增殖能力和組織修復(fù)治療能力，可能通過增加CXCR4的表達促進其向損傷器官組織的定向歸巢。EPO作為BMSC的預(yù)處理因素具有良好的應(yīng)用前景，這仍需進一步的動物模型，甚至大規(guī)模的臨床實驗進行探索。1.3.2移液槍頭麻黃將5組BMSC培養(yǎng)48h后接種于6孔板中，當(dāng)BMSC匯合達到80%～90%時，用移液槍槍頭在6孔板底部劃痕1次。倒置顯微鏡觀察BMSC的遷移情況。1.3.6熒光顯微鏡觀察EPO-BMSC組和BMSC組BMSC培養(yǎng)48h后，3%多聚甲醛溶液固定，加入抗微管蛋白的一抗37℃孵育45min,PBS沖洗后加入熒光標(biāo)記的二抗，熒光顯微鏡觀察微管染色情況；加入羅丹明-鬼筆環(huán)肽室溫避光反應(yīng)30min后，顯微鏡下觀察微絲染色情況。1.3.4表面標(biāo)志物測定將EPO-BMSC組和BMSC組的BMSC培