化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座

化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第1頁Contents化學(xué)發(fā)光免疫基本概念

化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)識技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析類型123電化學(xué)發(fā)光免疫4化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第2頁化學(xué)發(fā)光免疫基本概念

1化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第3頁1.1化學(xué)發(fā)光基本原理發(fā)光：是指分子或原子中電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子過程。依據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子能量起源不一樣可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。生物發(fā)光本質(zhì)是化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第4頁化學(xué)發(fā)光原理：伴隨化學(xué)反應(yīng)光發(fā)射現(xiàn)象

一些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過程中，因為吸收了反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)能而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長光，這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光過程稱為化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)

。

1.1化學(xué)發(fā)光基本原理化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第5頁化學(xué)發(fā)光分析依據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時刻發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)發(fā)光總量來確定反應(yīng)中對應(yīng)組分含量分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第6頁化學(xué)發(fā)光分析優(yōu)點化學(xué)發(fā)光含有熒光特異性，同時不需要激發(fā)光，就防止了熒光分析中激發(fā)光雜散光影響有很高靈敏度，而且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈環(huán)境污染和健康危害，是一個非常優(yōu)異定量分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第7頁化學(xué)發(fā)光分析缺點即使化學(xué)發(fā)光具備很高特異性和很小干擾，但化學(xué)分析本身不特異性，制約了整個方法使用。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第8頁化學(xué)發(fā)光免疫分析

Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)

特異性強(qiáng)

敏感性高

簡便、快速

重復(fù)性好化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第9頁1.2化學(xué)發(fā)光種類直接化學(xué)發(fā)光一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠能量把參加反應(yīng)物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可簡單地描述以下：A+B

C*+DC*

C+h

1化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第10頁1.2化學(xué)發(fā)光種類間接化學(xué)反應(yīng)發(fā)光

若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學(xué)反應(yīng)分子F上，使F分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，F(xiàn)分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可表示以下：

A+B

C*+DC*+F

F*+CF*

F+h2化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第11頁化學(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學(xué)激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射效率（φEM）?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)光效率、光輻射能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應(yīng)都含有其特征性化學(xué)發(fā)光光譜和不一樣化學(xué)發(fā)光效率。1.3化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第12頁化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第13頁

化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)識技術(shù)2化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第14頁2.1化學(xué)發(fā)光劑概念在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參加能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子形式釋放能量化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第15頁

化學(xué)發(fā)光劑選擇條件：①發(fā)光量子產(chǎn)率高；②物理-化學(xué)特征要與被標(biāo)識或測定物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)結(jié)果；⑤在所使用濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第16頁直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶催化作用，直接參加發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光特有基團(tuán)，可直接標(biāo)識抗原或抗體。

2.2化學(xué)發(fā)光劑種類直接化學(xué)發(fā)光劑，間接化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第17頁A.吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm光，含有很高發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系發(fā)光體。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第18頁

代表性物質(zhì)：光澤精(lucigenin)氧化劑：H2O2還原劑：乳酸尿酸抗壞血酸催化劑：過渡金屬離子、酶抑制劑：酚類物質(zhì)對此反應(yīng)有抑制作用間接測定：能夠生成H2O2基質(zhì)及對應(yīng)酶

max=445nm量子產(chǎn)率高，易于標(biāo)識，是發(fā)展化學(xué)發(fā)光免疫分析和DNA發(fā)光探針主要標(biāo)識物化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第19頁B.三聯(lián)吡啶釕

三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第20頁酶促反應(yīng)發(fā)光劑：利用標(biāo)識酶催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。A．魯米諾及其衍生物

B．AMPPD間接化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第21頁A.魯米諾及其衍生物魯米諾發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第22頁B．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第23頁A.碳二亞胺（EDC）縮正當(dāng)

2.3發(fā)光劑標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第24頁B.過碘酸鈉氧化法

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第25頁C．重氮鹽偶聯(lián)法化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第26頁D.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第27頁1．發(fā)光劑選擇

2．被標(biāo)識蛋白質(zhì)性質(zhì)

3．標(biāo)識方法選擇

4．原料比

5．標(biāo)識率

6．溫度2.4影響發(fā)光劑標(biāo)識原因化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第28頁化學(xué)發(fā)光免疫分析類型3化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第29頁用化學(xué)發(fā)光劑（吖啶酯或魯米諾類）直接標(biāo)識抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中對應(yīng)抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)識抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，化學(xué)發(fā)光劑在不需要催化劑情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、統(tǒng)計單位時間內(nèi)所產(chǎn)生光子能，這部分光積分與待測抗原量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原含量。3.1直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第30頁發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶吖啶酯標(biāo)識物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光機(jī)理（夾心法）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第31頁

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參加催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)識抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中對應(yīng)抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)識抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物濃度。3.2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第32頁該分析系統(tǒng)采取辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)識抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標(biāo)識抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。3.2.1辣根過氧化物酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第33頁辣根過氧化物酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

3.2.1辣根過氧化物酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第34頁該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)識抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)識抗體復(fù)合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。

3.2.2堿性磷酸酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第35頁堿性磷酸酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

3.2.2堿性磷酸酶標(biāo)識化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第36頁分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育，使反應(yīng)物結(jié)合在磁場中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號孵育,促使信號產(chǎn)生信號檢測化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第37頁電化學(xué)發(fā)光免疫4FlowcellFeOxidizedReduced化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第38頁Electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA20世紀(jì)80年代出現(xiàn)，90年代用于臨床檢測。ECLIA電化學(xué)免疫學(xué)化學(xué)發(fā)光發(fā)光特點：聯(lián)吡啶釕（標(biāo)識物+三丙胺自由基（催化）+三角形脈沖電壓（激發(fā)），0.01ms就可發(fā)出穩(wěn)定光。優(yōu)點：1.靈敏度高（聯(lián)吡啶釕再循環(huán)），2.檢測步驟簡化（游離/結(jié)合）3.可實現(xiàn)多元檢測4.可實現(xiàn)自動化化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第39頁在電極表面由電化學(xué)引發(fā)特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)識Ab，經(jīng)過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，依據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出光強(qiáng)度對待測Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。電化學(xué)發(fā)光免疫分析Electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA原理電化學(xué)發(fā)光、免疫分析檢測、生物素-抗生素、固相磁珠技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第40頁電化學(xué)發(fā)光劑定義：指經(jīng)過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光物質(zhì)。特點反應(yīng)在電極進(jìn)行化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕電子供體為：三丙胺（TPA）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第41頁ECL分析中采取[Ru(bpy)3]2+作為標(biāo)識物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羥基琥珀酸胺酯（NHS），該衍生物含有水溶性，且高度穩(wěn)定，確保電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)高效和穩(wěn)定，而且防止了本底噪聲干擾。三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+

特點化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第42頁[Ru(bpy)3]2+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合分子比超出20仍不會影響抗體可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空間位阻小，即便小分子核酸也能標(biāo)識，使檢測樣品種類大大豐富，更主要是為其檢測樣品種類開發(fā)前景提供了遼闊空間。三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+

特點化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第43頁1電化學(xué)反應(yīng)2化學(xué)發(fā)光3循環(huán)+ECLIA原理化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第44頁慣用方法類型固相磁性微球吸附采取固相載體是帶有磁性直徑約2.8μm聚苯乙烯微粒。其特點是反應(yīng)面積比板式擴(kuò)大20－30倍，吸附效率高；在液體中形成均勻懸液，參加反應(yīng)時類似液相，反應(yīng)速度大大加緊；鏈霉親和素-生物素吸附

“鏈霉親和素-生物素”是是含有很強(qiáng)非共價相互作用一對化合物，含有牢靠而特異結(jié)合，應(yīng)用此放大系統(tǒng)，使檢測靈敏度大大提升親和素—糖蛋白；生物素-維生素H化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第45頁ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心形成）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第46頁ECLIA檢測流程圖二（生物素與親和素結(jié)合）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第47頁ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第48頁ECLIA檢測流程圖三（磁珠吸引吸附于電極表面）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第49頁ECLIA檢測流程圖四（電極充電開啟電化學(xué)反應(yīng)）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第50頁ECLIA檢測流程圖五（撤消磁場沖洗磁珠）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)講義專家講座第51頁電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖化學(xué)發(fā)光免疫分析技