流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座

流式細胞術(shù)（flowcytometery,FCM）是20世紀70年代發(fā)展起來一個能夠快速、準確、客觀，可同時檢測單個微粒（通常是細胞）多項特征，并加以定量技術(shù)，而且能夠?qū)μ囟ㄈ后w加以分選。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第1頁研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究微粒特征包含各種物理及生物學特征，并加以定量。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第2頁流式細胞儀是一個集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機以及細胞熒光化學技術(shù)為一體新型高科技儀器。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第3頁流式細胞儀特點單個細胞或微粒分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細胞(微粒)/秒統(tǒng)計學意義：提供細胞群體均值和分布情況分選感興趣細胞或微粒流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第4頁其結(jié)構(gòu)普通分為5部分：流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；激光光源及光束形成系統(tǒng)；光學系統(tǒng)；信號檢測、存放、顯示分析系統(tǒng)；細胞分選系統(tǒng)。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第5頁（一）流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第6頁

流動室是儀器關鍵部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔中心，這種流動室光學特征良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可搜集細胞信號光通量大，配上廣角搜集透鏡，可取得很高檢測靈敏度和測量精度。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第7頁流動室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一個穩(wěn)定液體流動，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流速是不變，樣品流在鞘液環(huán)包下形成流體力學聚焦，使樣品流不會脫離液流軸線方向，而且確保每個細胞經(jīng)過激光照射區(qū)時間相等，從而得到準確細胞熒光信息。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第8頁流式細胞儀流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第9頁流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第10頁(二)激光光源與光束形成系統(tǒng)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第11頁當前臺式機FCM，大多采取氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高光照，是細胞微弱熒光快速分析理想光源。因為細胞快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)時間僅為1μs左右，每個細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出熒光信號強弱，與被照射時間和激發(fā)光強度相關，所以細胞需要足夠光照強度。

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第12頁激光光束在到達流動室前，先經(jīng)過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為22μm×66μm，即短軸稍大于細胞直徑光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為確保樣品中細胞受到光照強度一致，須將樣本流與激光束正交，且相交于激光能量分布峰值處。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第13頁流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第14頁(三)光學系統(tǒng)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第15頁流式細胞儀光學系統(tǒng)

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第16頁FCM光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，主要光學原件是濾光片，主要分成3類：長通濾片(long-passfilter，LP)、短通濾片(short-passfiltr，SP)及帶通濾片(band-passfilter，BP)。它們分別將不一樣波長熒光信號送到不一樣電子探測器流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第17頁流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第18頁流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第19頁(四)信號檢測與分析系統(tǒng)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第20頁1．散射光信號：散射光分為前向角散射(forwardscatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射(sidescatter,SSC)，散射光不依賴任何細胞樣品制備技術(shù)(如染色)，所以被稱為細胞物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。以上兩種信號都是來自激光原光束，其波長與激光波長相同。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第21頁前向角散射光（FSC,ForwardScatter） 細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射（SSC,SideScatter） 細胞粒度及細胞內(nèi)相對復雜性流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第22頁(1)前向角散射：前向角散射與被測細胞大小相關，確切地說，它與細胞直徑平方值親密相關。通常在FCM應用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中各種碎片及鞘液中小顆粒，以防止對被測細胞干擾。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第23頁(2)側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交90°方向散射光信號，側(cè)向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜折射率更為敏感，可提供相關細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)信息。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第24頁2．熒光信號

激光作用原理

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第25頁(1)熒光信號線性測量與對數(shù)測量

當攜帶熒光素細胞與激光正交時，受激發(fā)發(fā)出熒光，經(jīng)過濾光片分離不一樣波長光信號分別抵達不一樣光電倍增管(PMT)，PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號。電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第26頁細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等測量普通選取線性放大測量。在細胞膜表面抗原等檢測時，細胞膜表面抗原分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍。如用線性放大器，將無法在一張圖上清楚地將細胞陽性群、陰性群同時顯示出來通常使用對數(shù)放大器，假如原來輸出是1，當輸入增大到原來10倍時，輸出為2；當輸入增大到原來100倍時，輸出為3等。

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第27頁(2)熒光信號面積和寬度

所謂熒光信號面積是采取對熒光光通量進行積分測量，普通對DNA含量測量時，均采取面積(FL2－A)來計算。這是因為熒光脈沖面積比熒光脈沖高度更能準確反應DNA含量。熒光信號寬度(如FL2－W)慣用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第28頁(3)光譜重合校正

使用熒光賠償電路合理設置熒光信號賠償值。流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第29頁(五)FCM測量數(shù)據(jù)存放、顯示和分析流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第30頁流式細胞儀數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存放:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示: 直方圖(Histogram) 二維點圖(DotPlot) 等高線圖(ContourPlot) 密度圖(Density) 三維圖（3DPlot）等流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第31頁單參數(shù)直方圖每一個細胞單參數(shù)測量數(shù)據(jù)可整理成份布統(tǒng)計，以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示。在圖中，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，橫坐標能夠是線性，也能夠是對數(shù)，縱坐標普通是細胞數(shù)流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第32頁DNA含量直方圖和抗原表示直方圖

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第33頁雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用于表示來自同一細胞兩個參數(shù)與細胞數(shù)量關系，慣用表示方法有二維點圖(dotplot)、等高線圖(contourplot)、二維密度圖(densityplot)。在二維圖中，x坐標為某細胞一個參數(shù)數(shù)值，而Y坐標為該細胞另一參數(shù)數(shù)值。從雙參數(shù)圖形中能夠?qū)⒏骷毎麃喨簠^(qū)分開，同時可取得細胞相關主要信息。

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第34頁外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第35頁雙色熒光標識細胞散點圖流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第36頁等高圖和密度圖分析流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第37頁數(shù)據(jù)分析三維圖分析流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第38頁流式細胞儀科研應用樹突細胞研究干細胞研究癌癥病人多藥耐藥性細胞動力學功效研究環(huán)境微生物分析流式細胞術(shù)與分子生物學研究流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第39頁DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

流式細胞儀的構(gòu)造工作原理和數(shù)據(jù)分析專家講座第40頁腦栓塞病人血小板活化檢測