免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座

試驗目標了解雙向瓊脂擴散原理和用途。掌握抗體效價測定方法。觀察抗原、抗體在瓊脂板中形成沉淀線。免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第1頁試驗原理雙向雙擴散簡稱雙擴散，此法是一個定性試驗?？扇苄钥乖c對應抗體在瓊脂凝膠中各自向四面擴散，假如抗原和抗體相對應，則在二者百分比適當處形成白色沉淀線；若抗原和抗體無關就不會出現(xiàn)沉淀線。此試驗能夠檢測抗原或抗體純度，滴定抗體效價，以及用已知抗原（抗體）檢測和分析未知抗體（抗原）。免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第2頁試驗材料生理鹽水、1%瓊脂（用于制作瓊脂擴散試驗平板）已知傳染性法氏囊病毒抗原、待檢血清打孔器、微量加樣器、槍頭、酒精燈、搪瓷盒等免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第3頁試驗步驟制板：稱取1g瓊脂粉，加入100ml生理鹽水，煮沸使之溶解。待溶解瓊脂溫度降至60℃左右時倒入平皿中，厚度為2-3mm。注意勿產(chǎn)生氣泡。打孔：待瓊脂凝固好后用打孔器打孔，孔徑和孔距依不一樣疫病檢疫規(guī)程而定，普通孔徑3~5mm，孔間距4~7mm?？仔投酁?孔，中央1孔，周圍6孔（如梅花孔）。用針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。封底：將瓊脂板無凝膠面在酒精燈火焰上輕輕灼燒，用手背感受微燙即可。免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第4頁抗體效價測定：用微量加樣器于中央孔加入已知抗原，于周圍孔加倍比稀釋血清，每個稀釋度加1孔。加樣時不要使樣品外溢或在邊緣殘余小氣泡，以免影響擴散結(jié)果。擴散：加樣完成后，將瓊脂板放于濕盒內(nèi)，保持一定濕度，置于37℃溫箱中擴散24~48小時觀察結(jié)果。免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第5頁圖1免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第6頁結(jié)果判定用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證實為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不一樣。免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第7頁用梅花孔檢測抗血清效價，操作時將抗原置于中心孔，抗血清倍比稀釋后置于周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶血清最高稀釋倍數(shù)為該血清瓊擴效價。若凝膠中抗原、抗體是特異性，則形成抗原抗體復合物，在兩孔之間出現(xiàn)清楚致密白色沉淀線，為陽性反應。若在72小時內(nèi)仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應。試驗時最少要做一陽性對照。出現(xiàn)陽性對照與備檢樣品沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。結(jié)果判定免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第8頁雙向免疫擴散凝膠染色圖免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第9頁免疫擴散實驗雙向雙擴散生物技術第四組專家講座第10頁注意事項澆制瓊脂板時要均勻、無氣泡?？滓虻脠A整光滑，邊緣不要破裂。加樣時應盡可能防止氣泡或加到孔外，以確保結(jié)果準確性。注意微量進樣器每加一個樣品之后，更換槍頭。免疫擴散實驗雙向