免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座

試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)了解雙向瓊脂擴(kuò)散原理和用途。掌握抗體效價(jià)測定方法。觀察抗原、抗體在瓊脂板中形成沉淀線。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第1頁試驗(yàn)原理雙向雙擴(kuò)散簡稱雙擴(kuò)散，此法是一個(gè)定性試驗(yàn)?？扇苄钥乖c對(duì)應(yīng)抗體在瓊脂凝膠中各自向四面擴(kuò)散，假如抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，則在二者百分比適當(dāng)處形成白色沉淀線；若抗原和抗體無關(guān)就不會(huì)出現(xiàn)沉淀線。此試驗(yàn)?zāi)軌驒z測抗原或抗體純度，滴定抗體效價(jià)，以及用已知抗原（抗體）檢測和分析未知抗體（抗原）。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第2頁試驗(yàn)材料生理鹽水、1%瓊脂（用于制作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)平板）已知傳染性法氏囊病毒抗原、待檢血清打孔器、微量加樣器、槍頭、酒精燈、搪瓷盒等免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第3頁試驗(yàn)步驟制板：稱取1g瓊脂粉，加入100ml生理鹽水，煮沸使之溶解。待溶解瓊脂溫度降至60℃左右時(shí)倒入平皿中，厚度為2-3mm。注意勿產(chǎn)生氣泡。打孔：待瓊脂凝固好后用打孔器打孔，孔徑和孔距依不一樣疫病檢疫規(guī)程而定，普通孔徑3~5mm，孔間距4~7mm。孔型多為7孔，中央1孔，周圍6孔（如梅花孔）。用針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。封底：將瓊脂板無凝膠面在酒精燈火焰上輕輕灼燒，用手背感受微燙即可。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第4頁抗體效價(jià)測定：用微量加樣器于中央孔加入已知抗原，于周圍孔加倍比稀釋血清，每個(gè)稀釋度加1孔。加樣時(shí)不要使樣品外溢或在邊緣殘余小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。擴(kuò)散：加樣完成后，將瓊脂板放于濕盒內(nèi)，保持一定濕度，置于37℃溫箱中擴(kuò)散24~48小時(shí)觀察結(jié)果。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第5頁圖1免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第6頁結(jié)果判定用以檢測抗原或比較抗原差異時(shí)，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證實(shí)為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不一樣。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第7頁用梅花孔檢測抗血清效價(jià)，操作時(shí)將抗原置于中心孔，抗血清倍比稀釋后置于周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶血清最高稀釋倍數(shù)為該血清瓊擴(kuò)效價(jià)。若凝膠中抗原、抗體是特異性，則形成抗原抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)清楚致密白色沉淀線，為陽性反應(yīng)。若在72小時(shí)內(nèi)仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)最少要做一陽性對(duì)照。出現(xiàn)陽性對(duì)照與備檢樣品沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。結(jié)果判定免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第8頁雙向免疫擴(kuò)散凝膠染色圖免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第9頁免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向雙擴(kuò)散生物技術(shù)第四組專家講座第10頁注意事項(xiàng)澆制瓊脂板時(shí)要均勻、無氣泡。孔要打得圓整光滑，邊緣不要破裂。加樣時(shí)應(yīng)盡可能防止氣泡或加到孔外，以確保結(jié)果準(zhǔn)確性。注意微量進(jìn)樣器每加一個(gè)樣品之后，更換槍頭。免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向