丹參注射液促心肌梗塞后大鼠缺血心肌血管新生作用及對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子的影響研究

丹參注射液促心肌梗塞后大鼠缺血心肌血管新生作用及對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子的影響研究【摘要】目的觀察丹參注射液對(duì)心肌梗塞后大鼠缺血心肌血管新生作用，并探討其機(jī)制。方法雄性Wistar大鼠，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造成急性心肌梗塞模型，隨機(jī)分為丹參注射液組、麝香保心丸組、模型組，并設(shè)假手術(shù)組，6周后處死動(dòng)物。用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)各組大鼠缺血心肌中微血管數(shù)、微血管密度及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子β、胰島素樣生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá)，用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)灰度值并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果模型組、麝香保心丸組及丹參注射液組大鼠MI邊緣區(qū)MVC和MCD較假手術(shù)組明顯增多；丹參注射液組大鼠缺血心肌局部MVC和MVD明顯高于模型組，與麝香保心丸組作用相似。模型組VEGF，bFGF-β，IGF-1蛋白表達(dá)及其灰度值明顯高于假手術(shù)組；丹參注射液組VEGF，bFGF，PDGF-β蛋白表達(dá)灰度值明顯高于模型組，而IGF-1蛋白表達(dá)灰度值低于模型組VEGF，bFGF，PDGF-β，IGF-1蛋白表達(dá)灰度值低于麝香保心丸組。結(jié)論丹參注射液有促M(fèi)I后大鼠缺血心肌血管新生的作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)VEGF，bFGF，PDGF-β的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】丹參注射液心肌梗塞血管新生分子機(jī)制

StudyofAngiogenesisandCorrelativeGrowthFactorsEffectsofSalviamiltiorrhizaInjectionontheIschemicMyocardiumoftheRatsafterMyocardialInfarction

Abstract：ObjectiveTostudytheangiogenesiceffectsandmechanismsofSalviamiltiorrhizaInjectionontheischemicmyocardiumoftheratsaftermyocardialinfarction(MI).MethodsMalewistarratswereligatedleftcoronaryarterytobemadeintomodelsofacutemyocardialinfarction(AMI).AllratswererandomlydividedintoSalviamiltiorrhizaInjection,Shexiangbaoxinpills(positivecontrolgroup),model(negativecontralgroup)groupandshamoperationgroup.Treatedthemrespectivelyforsixweeks.Microvascularcount(MVC),microvasculardensity(MVD),vascularendothelialgrowthfactor(VEGF),basicfibroblastgrowthfactor(bFGF),insulin-kindgrowthfactor(IGF)andplatelet-derivedendothelialgrowthfactor(PDGF)inischemicmyocardiumofMIratsweredetectedbyimmunobistochemistryassay.ThevaluesofproteinexpressionofVEGF,bFGF,PDGF-βandIGF-1onischemicmyocardyzumwerecalculatedandanaliedbyimageanalysisThereweremoreMVCandMVDinischemicmyocardiumofAMIratsofmodelgroup、salviamiltiorrhizainjectiongroup,Shexiangbaoxinpillsgroupthanshamoperationgroup.MVCandMVDwerehigherinischemicmyocardiumofAMIratsofSalviamiltiorrhizaInjectiongroupthanthoseofmodelgroup.ComparedwithShexiangbaoxinpills,theyhadthesameroll.ThevaluesofproteinexpressionofVEGF,bFGF,PDGF-βandIGF-1inmodelgroupweresignificantlyelevatedcomparedwiththatinshamoperationgroup.TheproteinexpressionofVEGF,bFGFandPDGF-βinsalviamiltionrrhizainjectiongroupwassignificantlyelevatedcomparedwiththatinshamoperationgroup.TheproteinexpressionofVEGF,bFGFandPDGF-βinSalviamiltiorrhizaInjectiongroupwassignificantlyelevatedcomparedwiththatinmodelgroup.IGF-1inSalviamiltiorrhizaInjectiongroupwaslowerthanmodlegroup.Buttherewasnosignificantstatisticsdifferencebetweenthem.ThereweresignificantstatisticsdifferencesintheproteinexpressionofVEGF,bFGF,PDGF-βandIGF-1insalviamiltiorrhizainjectiongroupcomparedwiththatinShexiangbaoxinpillsgroup.ConclusionSalviamiltiorrhizaInjectionhastheeffectofpromotingangiogenesisoftheischemicmyocardiuminratsafterMI.ItsmechanismscanberelatedwithstimulatingtheexpressionofVEGF,bGFGandPDGF-β.

Keywords：SalviamiltiorrhizaInjection;MI;Angiogenesis;Molecularmechanism

本研究觀察丹參注射液對(duì)MI后大鼠缺血心肌血管新生的影響，并通過觀察其對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)水平的變化探討促血管新生作用機(jī)制。

1材料與方法

材料

藥品丹參注射液，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)031001；麝香保心丸，上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)A040214，把麝香保心丸粉碎后溶于無菌蒸餾水中，每毫升含麝香保心丸3mg。

試劑小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體，購自美國(guó)Santa公司，生物素化二抗、三抗、非免疫血清購自福建邁新公司；VEGF、bFGF、IGF-1、PDGF-β免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，SP-9001RabbitSPKit購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中山公司。

器材小動(dòng)物呼吸機(jī)；顯微鏡；石蠟切片機(jī)；彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

動(dòng)物造模及分組選取體重為g的Wistar雄性大鼠，參照文獻(xiàn)方法［1］，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背位固定，行氣管插管術(shù)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，人工呼吸，開胸結(jié)扎左冠脈根部，以即刻心臟表面顏色變化和術(shù)后心電圖1、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段顯著抬高顯示造模成功，縫合胸壁，觀察大鼠生理狀態(tài)平穩(wěn)后，停止人工呼吸，術(shù)后注射青霉素3d預(yù)防感染。成活動(dòng)物隨機(jī)分為丹參注射液組、麝香保心丸組、模型組，假手術(shù)組手術(shù)方法同上，但在冠狀動(dòng)脈下穿線后打一松結(jié)。

治療方法造模后24h內(nèi)開始藥物干預(yù)，給藥1次/d。假手術(shù)組腹腔注射生理鹽水10ml·kg-1·d-1；丹參注射液組腹腔注射丹參注射液g·kg-1·d-1；麝香保心丸組管飼麝香保心丸30mg·kg-1·d-1；模型組管飼與治療組同等容積的生理鹽水10ml·kg-1·d-1。6周后處死動(dòng)物。

心肌取材麻醉大鼠后取出心臟，剪去主動(dòng)脈弓、右心室、心房、心耳等，在乳頭肌橫切面切取心肌組織，10%中性緩沖福爾馬林液固定，石蠟包埋，制備厚4μm組織切片。

觀察指標(biāo)

一般組織形態(tài)學(xué)觀察切片脫臘，二甲苯透明，HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固，光鏡觀察。

大鼠MI邊緣區(qū)心肌MVC，MVD的測(cè)定用免疫組織化學(xué)法染色組織切片。一抗工作濃度為1∶100。染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成黃、棕色。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：按參考文獻(xiàn)方法［2］，不以紅細(xì)胞的出現(xiàn)來確定是否為血管，也不以是否出現(xiàn)管腔來計(jì)數(shù)血管，凡是染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，凡管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層血管區(qū)域的血管均不計(jì)數(shù)。具體方法為：先在40×視野下找到MI邊緣區(qū)，然后在400×視野下進(jìn)行大鼠MI邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的MVC，取其均值作為本例大鼠的MVC值，因MVD以毛細(xì)胞血管個(gè)數(shù)/視野表示，故每例的MVC值即為該大鼠的MVD值。

大鼠MI邊緣區(qū)心肌VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法染色組織切片。兔抗鼠VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1多克隆抗體工作濃度為1∶100。VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1蛋白的表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。用病理圖象分析系統(tǒng)計(jì)算MI邊緣區(qū)心肌每100×視野中平均灰度值。每張切片隨機(jī)測(cè)定6個(gè)視野，取其均值作為該大鼠的灰度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用ForWindows統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)算所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

一般組織形態(tài)學(xué)觀察假手術(shù)組可見毛細(xì)血管增生不明顯；模型組可見少量毛細(xì)血管增生；麝香保心丸組可見較多增生的毛細(xì)血管；丹參注射液組可見明顯增生的毛細(xì)血管。

各組大鼠MI邊緣區(qū)MVC和MVD比較假手術(shù)組、模型組、麝香保心丸組及丹參注射液均可看到新生的微血管，在顯微鏡下計(jì)數(shù)各組大鼠MI邊緣區(qū)MVC和MVD后，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、麝香保心丸組及丹參注射液MVC和MVD均明顯增多；丹參注射液組、麝香保心丸組MVC和MVD較模型組明顯增多；而丹參注射液組和麝香保心丸組作用相似。結(jié)果見表1。表1各組大鼠MI邊緣區(qū)MVC，MVD的比較

各組大鼠MI邊緣區(qū)VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)及其灰度值光鏡下，VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1的陽性染色呈棕黃色，陽性區(qū)域主要分布于心肌細(xì)胞胞漿。模型組VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1蛋白陽性染色范圍較?。患偈中g(shù)組正常心肌細(xì)胞中可見少量弱陽性表達(dá)，呈不規(guī)則黃褐色點(diǎn)狀物；模型組明顯多于假手術(shù)組；麝香保心丸組4種蛋白陽性染色范圍大，4種蛋白表達(dá)明顯多于模型組；丹參注射液組VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白陽性染色范圍較大，表達(dá)明顯多于模型組，IGF1蛋白陽性染色范圍較小，表達(dá)少于模型組?；叶戎狄姳?。表2各組大鼠心肌梗塞邊緣區(qū)VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)的灰度值

模型組VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)及其灰度值明顯高于假手術(shù)組；丹參注射液組VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白表達(dá)灰度值較模型組明顯增高，IGF1蛋白表達(dá)灰度值低于模型組，兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹參注射液組VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)灰度值低于麝香保心丸組，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

心臟冠脈側(cè)枝循環(huán)的形成和開放能減輕心肌缺血、防止細(xì)胞壞死、預(yù)防和延緩缺血性心肌病的形成、改善病人的臨床癥狀和預(yù)后，而血管新生可促進(jìn)缺血周邊組織側(cè)枝循環(huán)建立。MVD是普遍采用的能夠反映血管新生強(qiáng)度的有效指標(biāo)。目前認(rèn)為CD34是較特異和敏感的生長(zhǎng)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，并且有較強(qiáng)的可重復(fù)性［3］。新近報(bào)道顯示，CD34顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)其特異性最高，優(yōu)于內(nèi)皮細(xì)胞的其他標(biāo)記物［4］，故本研究采用抗CD34單抗來檢測(cè)大鼠心肌組織切片中血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)狀況，用以反映血管新生狀況、顯示和計(jì)算MVC和MVD。本研究顯示，大鼠MI后，MI邊緣區(qū)CD34表達(dá)增強(qiáng)，MVC，MVD明顯增加，這表明心肌缺血以后，啟動(dòng)了血管新生的過程，使缺血心肌新生血管增加以改善供血。分子生物學(xué)研究表明，心肌缺血缺氧時(shí)的血管新生均是通過生長(zhǎng)因子的作用而引起的［5］。以VEGF，bFGF為最重要，PDGFβ和IGF1也參與了血管新生的過程。心肌缺血缺氧時(shí)，VEGF和bFGF及受體的表達(dá)增強(qiáng)［6］。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表達(dá)及灰度值明顯高于假手術(shù)組，提示缺血缺氧可誘導(dǎo)VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1的表達(dá)。

丹參注射液是從丹參中提取的酮類化合物。研究表明［7～9］，該藥有保護(hù)缺血心肌、預(yù)防冠狀動(dòng)脈形成術(shù)后再狹窄、改善微循環(huán)、改善血流動(dòng)力學(xué)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用。本研究顯示，丹參注射液能使大鼠MI邊緣MVC，MVD明顯增加，與麝香保心丸作用相似，表明該藥有促進(jìn)或誘導(dǎo)缺血心肌血管新生的作用。本研究還顯示，丹參注射液可促進(jìn)MI后大鼠缺血心肌VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白的表達(dá)，對(duì)IGF1的表達(dá)則無明顯的促進(jìn)作用，其促進(jìn)VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白的表達(dá)作用不及麝香保心丸。通過4種生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與促血管新生的水平大體上是一致的，提示丹參注射液促血管新生作用與上調(diào)VEGF，bFGF,PDGFβ的表達(dá)有關(guān)。有報(bào)道，麝香保心丸有促M(fèi)I后大鼠缺血心肌血管新生及促VEGF，bFGF表達(dá)的作用［10］，故選該藥作為對(duì)照，結(jié)果與報(bào)道相一致，而且發(fā)現(xiàn)其促血管新生作用還可能與促進(jìn)PDGFβ，IGF1表達(dá)有關(guān)。盡管丹參注射液能上調(diào)VEGF，bFGF,PDGFβ的表達(dá)，但其機(jī)理是什么，用藥時(shí)間多長(zhǎng)為宜，最佳有效劑量是多少，均有待進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

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