環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠制備固定化金屬親和層析介質(zhì)

環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠制備固定化金屬親和層析介質(zhì)

1環(huán)氧氯丙烷法隨著生物技術(shù)的發(fā)展，固定化金屬親和色度技術(shù)（imac）技術(shù)在蛋白質(zhì)中的分離和精制（imark）。通常環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖都以水為反應(yīng)介質(zhì),環(huán)氧氯丙烷在水中的溶解度約為6.58%左右,因此該反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的油(環(huán)氧氯丙烷)-水-固(凝膠)三相反應(yīng)體系,反應(yīng)速率較慢;同時(shí)環(huán)氧化過(guò)程中環(huán)氧基在堿性條件下極易發(fā)生水解副反應(yīng),需要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行全面優(yōu)化和嚴(yán)格控制才能獲得較高的活化效率本工作考察了環(huán)氧氯丙烷在DMSO中對(duì)瓊脂糖凝膠Sepharose6FF進(jìn)行活化的反應(yīng)條件,結(jié)果表明通過(guò)條件優(yōu)化環(huán)氧基密度可達(dá)163μmol/mL.以IDA為螯合劑制備出了高金屬離子密度的Cu2材料和方法2.1bsa、環(huán)氧氯丙烷、乙二胺四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四鈉dmso及unimasic瓊脂糖凝膠Sepharose6FF購(gòu)自瑞典GEHealthcare公司,牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,其他試劑包括二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)、環(huán)氧氯丙烷(Epichlorohydrin,ECH)及IDA、乙二胺四乙酸四鈉鹽(EthylenediamineTetraaceticAcid,EDTA)、五水硫酸銅、咪唑等均為分析純,購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司.Unico2800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司).2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1dmso溶液的配制量取保存于20%(?)乙醇水溶液中的Sepharose6FF約20mL(沉降體積),在G4沙芯漏斗中用蒸餾水反復(fù)洗滌以除去乙醇,真空抽干至無(wú)水滴滴下.向介質(zhì)中依次加入20%,50%,70%(?)的DMSO水溶液各40mL,攪拌清洗5min,每次清洗后用真空抽干清洗液.從處理好的瓊脂糖凝膠中稱(chēng)取6份每份約1.0g介質(zhì)加入50mL錐形瓶中,向每份介質(zhì)中依次加入一定量DMSO,ECH,H2.2.2ida和cu取約15g環(huán)氧氯丙烷活化過(guò)的瓊脂糖凝膠,加入50mL含1.0mol/LIDA,2.0mol/LNaCu2.2.3imac介質(zhì)對(duì)bsa的吸附和洗脫BSA在IMAC介質(zhì)上的吸附平衡實(shí)驗(yàn)在含0.5mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.0)中進(jìn)行.吸附前先將制備好的IMAC介質(zhì)在緩沖液中平衡24h以上,真空抽濾后準(zhǔn)確稱(chēng)取一系列約0.1g的介質(zhì)于三角瓶中,加入10mL初始濃度為0～2.0mg/mL的BSA溶液,將三角瓶置于25℃搖床中,在170r/min下振蕩20h,取出,離心15min,以未加蛋白的空白為參比液,在280nm下測(cè)定上清液的吸光度.根據(jù)物料平衡計(jì)算吸附量:其中,q為蛋白質(zhì)的吸附量(mmol/L),c分別采用由pH5.0的吸附緩沖液配制的0.2mol/L咪唑溶液及0.05mol/L的磷酸緩沖液(pH8.0)對(duì)吸附在IMAC介質(zhì)上的BSA進(jìn)行洗脫.首先稱(chēng)取2份0.1gIMAC介質(zhì)于三角瓶中,加入6mL1.5mg/mLBSA溶液,25℃下于160r/min搖床中吸附20h后,離心測(cè)定上清液的吸光度,計(jì)算吸附在介質(zhì)上的BSA量.移去上清液后,向介質(zhì)中分別加入6mL咪唑溶液或pH8.0的磷酸緩沖液對(duì)BSA進(jìn)行洗脫,間隔一定時(shí)間測(cè)定上清液中洗脫下的BSA濃度,根據(jù)物料衡算計(jì)算出BSA的洗脫率.2.3分析2.3.1ida配基密度的測(cè)定IDA為弱酸,可采用過(guò)量強(qiáng)堿滴定后再用鹽酸滴定剩余強(qiáng)堿的方式來(lái)測(cè)定IDA-Sepharose凝膠表面的羧基含量,具體步驟為:準(zhǔn)確稱(chēng)取IDA-Sepharose微球0.1g于錐形瓶中,加3滴酚酞指示劑,5mL0.01mol/LNaOH,于室溫下振蕩反應(yīng)10min后,用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至紅色消失,平行滴定3次,記錄所用HCl體積.用下式計(jì)算介質(zhì)上的IDA配基密度:其中,D2.3.2CuIMAC介質(zhì)上Cu3結(jié)果與討論3.1sdo含量對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂活性密度的影響雖然史清洪等3.2ech含量對(duì)環(huán)在以DMSO為溶劑的無(wú)水反應(yīng)體系中,研究了ECH含量對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響,結(jié)果如圖3所示.當(dāng)ECH含量從10%增加到40%(?)時(shí),環(huán)氧基密度逐步由94.1μmol/mL增大到136.7μmol/mL;進(jìn)一步增加ECH含量,環(huán)氧基密度卻有所降低,這與文獻(xiàn)3.3活化溫度和時(shí)間對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響圖4表明,在40～60℃之間改變活化反應(yīng)溫度,對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響并不是特別顯著,50℃下活化所得環(huán)氧基密度略大于40和60℃.活化反應(yīng)時(shí)間對(duì)環(huán)氧基的修飾密度的影響較顯著(圖5),反應(yīng)時(shí)間達(dá)4h時(shí),所得環(huán)氧基密度最大,之后進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,環(huán)氧基修飾密度呈下降趨勢(shì).這與Matsumoto等通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),確定環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠的最佳反應(yīng)條件為:不含水的情況下,反應(yīng)體系中DMSO和ECH的體積分率分別為60%和40%,NaOH用量為0.02g/mL,活化反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為50℃和4h,所得環(huán)氧基密度最高可達(dá)163.5μmol/mL,這是國(guó)內(nèi)外報(bào)道通過(guò)顯微鏡對(duì)環(huán)氧基活化前后Sepharose6FF微球進(jìn)行對(duì)比觀察,并未發(fā)現(xiàn)活化前后微球形態(tài)有變化.3.4基密度和密度的影響在上述優(yōu)化條件下,對(duì)約20mLSepharose6FF進(jìn)行環(huán)氧化,測(cè)得環(huán)氧基密度為144.0μmol/mL,略低于優(yōu)化條件下所得的最大值(163.5μmol/mL).這是因?yàn)閮?yōu)化實(shí)驗(yàn)中每次活化的瓊脂糖凝膠僅為1g,反應(yīng)過(guò)程中瓊脂糖凝膠的分散程度更好.利用所制的ECH-Sepharose,按圖2所示步驟依次進(jìn)行IDA和Cu3.5bsa吸附和洗脫imac介質(zhì)BSA在IMAC上的吸附量在pH為5～6時(shí)最大吸附在IMAC介質(zhì)上的蛋白質(zhì)的洗脫采用競(jìng)爭(zhēng)性替代劑如咪唑作為洗脫劑4環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖介質(zhì)(1)以DMSO為溶劑完全取代水,在無(wú)水體系中利用環(huán)氧氯丙烷對(duì)瓊脂糖凝