dna的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

dna的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

“從本質(zhì)上提取和鑒定”是高中生物材料的實(shí)驗(yàn)。在新教材《生物技術(shù)》（成人教育版）中對(duì)“dna和蛋白質(zhì)技術(shù)”進(jìn)行了分析。一章5。學(xué)習(xí)的學(xué)生主要是理科生中對(duì)生命科學(xué)有濃厚興趣的學(xué)生,如何在普通高中實(shí)驗(yàn)室條件下、做好這個(gè)實(shí)驗(yàn)?筆者在許多高中教師實(shí)驗(yàn)“簡(jiǎn)化”的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了研究和優(yōu)化。該實(shí)驗(yàn)的材料可以選擇動(dòng)物材料(如雞血),也可以選擇植物材料(如菜花、洋蔥、香蕉等)。前者,取材不方便、成本高、實(shí)驗(yàn)操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng),效果不明顯;后者,菜花含水量少、細(xì)胞破裂情況及DNA溶出量少查閱了近幾年文獻(xiàn)資料,以香蕉為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定,高中教師受條件限制(如無(wú)EDTA、Tris、氯仿、異戊醇和離心設(shè)備等),仍摸索總結(jié)出一些“簡(jiǎn)化”實(shí)驗(yàn)的方法,其中有詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟描述的是鄭煥強(qiáng)老師1“簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)”的原型1香蕉研磨法(1)加5mL溫水和食鹽研磨一段約2cm長(zhǎng)的去皮香蕉。(2)研磨均勻后再加溫水,總加水量約為實(shí)驗(yàn)所用香蕉體積的3~4倍。(3)用紗布過(guò)濾研磨液,存入廣口瓶。留研磨液量約1/6~1/8瓶。2冰酒精研磨液量的確定(1)向廣口瓶?jī)?nèi)加入1~2湯匙洗潔精,按一定方向輕搖5min。(2)沿玻璃棒從瓶壁緩慢加入75%~90%的冰酒精,加入量約為研磨液量的3~4倍。(3)靜置5min后,用玻璃棒緩緩卷起上層漂浮的DNA粗提取物,放入已注有5mL物質(zhì)的量濃度為0.015mol/L的氯化鈉溶液的大試管中,攪拌使其充分溶解備用。3“dna”粘連物11個(gè)實(shí)驗(yàn)小組進(jìn)行到實(shí)驗(yàn)步驟2時(shí),都能迅速見(jiàn)到乳白色濾液分為上、下層,下層較渾濁,上層澄清、漂浮著析出的白色絮狀的“DNA”粘稠物(圖1),用玻璃棒(牙簽代替)卷起很多粘稠物(圖2);但是,DNA鑒定時(shí)只有1組有明顯的顏色反應(yīng)(變藍(lán)色),其他各組只是難以識(shí)別的、淡淡的淺藍(lán)色或者不變色。2含dna量少,純度較低析出的白色絮狀粘稠物,能夠溶于2mol/L的NaCl溶液,說(shuō)明含有DNA;但是,DNA鑒定時(shí),多數(shù)是淡淡的淺藍(lán)色或者不變色,說(shuō)明含DNA量較少、純度較低。師生共同分析,可能絮狀提取物中含有大量蛋白質(zhì),一致認(rèn)為用雙縮脲試劑檢驗(yàn),結(jié)果溶液變紫色。如何提取到更多的DNA,并去除濾液中的雜質(zhì)、獲取較為純凈的DNA呢?學(xué)生根據(jù)教材第54~57頁(yè)的理論,提出2個(gè)主要問(wèn)題。2.1在“研磨”和“研磨后”中添加洗滌劑，有利于吸收和提取dna洗潔精中含有SDS(十二烷基磺酸鈉),能夠裂解細(xì)胞膜,利于DNA從細(xì)胞中釋放;具有使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離作用,有利于提取DNA2.2在生物樣品中添加1.4%的果汁蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能耐受60~80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會(huì)變性。嫩肉粉中的木瓜蛋白酶的最適溫度是55~60℃(pH3~9.5),如果在濾液中加入嫩肉粉,反應(yīng)10~15min,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶不僅能分解蛋白質(zhì),而且高溫能使部分蛋白質(zhì)變性,達(dá)到純化DNA提取物的效果。在討論的基礎(chǔ)上,結(jié)合中學(xué)教材和實(shí)驗(yàn)室條件,對(duì)DNA釋放和DNA純化的步驟進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行簡(jiǎn)化(如廣口瓶改為小燒杯、玻璃棒改為牙簽等),試劑的量進(jìn)行具體化。3優(yōu)化實(shí)驗(yàn),擴(kuò)大了實(shí)驗(yàn)“純度”1)制取香蕉研磨液。(1)取一段約2cm長(zhǎng)的去皮香蕉,剪碎置于研缽中。(2)加入10mL溫水、2g食鹽和1~2滴(約0.1~0.2mL)廚房用洗潔精,研磨5~10min。(3)用雙層紗布過(guò)濾研磨液,濾液于小燒杯中。2)粗提取DNA。(1)向?yàn)V液中加入2g嫩肉粉,輕搖小燒杯,讓嫩肉粉和濾液充分接觸。(2)把小燒杯置于60℃的水浴鍋中加熱10min。(3)待小燒杯冷卻后,沿玻璃棒從燒杯壁緩慢加入2倍體積的95%的室溫酒精(用室溫的酒精代替冰酒精,析出的DNA的量無(wú)明顯差異3)鑒定提取物。(1)取2支試管,分別編為1號(hào)、2號(hào),各加入2mol/L的NaCl溶液5mL,將所得的白色粘稠物放入1號(hào)試管,攪拌使其溶解。(2)向2支試管中分別加入4mL新配置的二苯胺試劑,混勻,在沸水浴中加熱10min。(3)待試管冷卻后,觀察顏色變化。這次,11個(gè)實(shí)驗(yàn)小組再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn),全部成功:1號(hào)試管為清晰的藍(lán)色,2號(hào)試管不變色(圖3);學(xué)生還興趣盎然地用雙縮脲試劑對(duì)白色粘稠物進(jìn)行檢驗(yàn),紫色和優(yōu)化前相比變淡;定性說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后,白色粘稠物中蛋白質(zhì)含量下降、而DNA的“純度”明顯提高了。整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究的過(guò)程,不僅培養(yǎng)學(xué)生利用理論知識(shí),提高了分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力,感受書本知識(shí)的發(fā)展價(jià)值,而且養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和孜孜以求的科學(xué)精神,取得了很好的教學(xué)效果。實(shí)驗(yàn)材料:市售香蕉。實(shí)驗(yàn)試劑:(1)二苯胺試劑(無(wú)色)(A液:1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中,再加1.5mL濃硫酸,棕色瓶保存;B液:0.2%的乙醛溶液;臨