細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第十二章細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存、生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)概念細(xì)胞培養(yǎng)目的和作用基礎(chǔ)研究1)藥物作用機(jī)理2)基因功能3)疾病發(fā)生機(jī)理生物制藥1)疫苗生產(chǎn)2)基因工程藥物生產(chǎn)3)細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件：環(huán)境、設(shè)備、器材、試劑

實(shí)驗(yàn)操作者工作范疇：無菌操作、溫育、培養(yǎng)液配置、洗刷、無菌處理、細(xì)胞和用品儲(chǔ)存等

實(shí)驗(yàn)室條件

無菌環(huán)境儀器設(shè)備普通器材一般試劑

無菌室結(jié)構(gòu)模式圖儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮罐、低溫冰箱、重蒸水裝置、負(fù)壓真空泵、普通冰箱、消毒鍋、烤箱、水浴鍋、天平等

二氧化碳培養(yǎng)箱

back超凈工作臺(tái)

back倒置顯微鏡back液氮罐back普通器材玻璃瓶皿：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管、抽慮瓶等塑料瓶皿：多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等

培養(yǎng)用品培養(yǎng)瓶（25、75cm3）培養(yǎng)板（96、48、24、12、6孔）培養(yǎng)皿（各種直徑規(guī)格）培養(yǎng)用品離心管（15、50ml）移液管、吸管凍存管、EP管試劑瓶等。二、細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其配制一般試劑

水平衡鹽液

培養(yǎng)液消化液抗生素液

pH調(diào)整液

平衡鹽液平衡鹽溶液的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡,保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)平衡鹽溶液用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑.使用要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱

HanksD-HanksEarlePBSHBSS

培養(yǎng)液

使用培養(yǎng)液：

天然培養(yǎng)基5-20%

合成培養(yǎng)基80-95%

附加成分再加適量抗生素液，調(diào)整pH值即可

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)條件細(xì)胞培養(yǎng)用試劑培養(yǎng)基a-MEM(minimumEagle’smedium)、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清添加因子生長因子（EGF、bFGF、BFGF）、胰島素、肝素、二巰基乙醇等抗生素液

鏈霉素(100ug/ml)

青霉素(100單位/ml)

制霉菌素(100單位/ml)

終濃度不超過萬分之一為宜

消化液

胰蛋白酶(0.125-0.25%)

膠原酶(0.1-0.3mg/ml)EDTA(0.01-0.02%)pH調(diào)整液5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOH

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

清洗：玻璃、塑料、橡膠、金屬類等消毒：無菌室、培養(yǎng)用液、培養(yǎng)器皿（玻璃、塑料、橡膠、金屬）等

三、細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

消毒：無菌室、培養(yǎng)用液、培養(yǎng)器皿（玻璃、塑料、橡膠、金屬）等

消毒方法物理消毒法：射線、紫外線、干熱、濕熱、過濾、煮沸等 化學(xué)消毒法：乳酸、甲醛、過氧乙酸、新潔爾滅、乙醇等抗生素滅菌細(xì)胞來源一.原代培養(yǎng)從機(jī)體上取下細(xì)胞、組織或器官，讓它們?cè)隗w外維持與生長。（實(shí)際中，傳10代以內(nèi)的細(xì)胞用作原代培養(yǎng)細(xì)胞）特點(diǎn)：表現(xiàn)來源組織或細(xì)胞特征。（1）

組織塊培養(yǎng)法從機(jī)體上取下組織，使其在體外維持與生長，細(xì)胞從組織塊邊緣向外長出，鋪滿培養(yǎng)瓶（皿），即可進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動(dòng)物處死：將出生2～3d乳鼠，用脫頸方法處死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切：在無菌條件下將組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去多余的組織（脂肪等），用PBS液洗滌1-2次；放入另一培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm3大小的塊。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3～5×105個(gè)細(xì)胞為宜。5)分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶or培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6)觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)法注意事項(xiàng)取材時(shí)要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中。取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作。用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或40C冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm2以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24小時(shí)，因放置時(shí)間長或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。在傳代時(shí)，需要用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTA溶液與胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。貼壁生長細(xì)胞傳代方法注意問題操作全過程注意無菌操作胰酶消化時(shí)間要適度吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡貼壁生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形10分鐘-4小時(shí)貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物：膠原、玻璃、塑料等細(xì)胞株平均在10分鐘-4小時(shí)貼壁血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、停止期潛伏期：細(xì)胞有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，細(xì)胞株潛伏期一般為6-24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期：細(xì)胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)----細(xì)胞凍存

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。預(yù)先配制凍存液：培養(yǎng)基+20%血清+10%DMSO

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期，加入1ml細(xì)胞于凍存管中，立即密封后放入凍存盒，或-20°C冰箱，然后放入-80°C冰箱，最后放入液氮。細(xì)胞凍存方法細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1-2分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)變化生長良好細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。生長狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰喞鰪?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙加大。四、細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)觀察培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。變紅或紫紅色，表示PH值上升，細(xì)胞生長停滯、死亡。一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞需要2-3天換液1次，生長慢的細(xì)胞需要3-4天換液一次。細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物，因此一般包括微生物(真菌、細(xì)菌、病毒和支原體)、化學(xué)物質(zhì)(影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成份)及細(xì)胞(非同一種的其它細(xì)胞)。其中以微生物污染最多見。另外隨著細(xì)胞種類增多．不同種細(xì)胞交叉污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。污染的途徑空氣：空氣是微生物傳播的最主要途徑。凈化工作臺(tái)使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進(jìn)行工作時(shí)不戴口罩或面對(duì)操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強(qiáng)減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。污染的途徑器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底CO2溫箱．由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌孽生，而CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)．如不定期消毒,可形成污染.污染的途徑操作無菌觀念不強(qiáng)、動(dòng)作不準(zhǔn)確、使用污染的器具或封瓶時(shí)不嚴(yán)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。污染的途徑血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細(xì)胞生長。污染對(duì)細(xì)胞的影響支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長期的、緩慢的和潛在的霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。化學(xué)物質(zhì)污染如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時(shí)排出，細(xì)胞仍可存活．但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化細(xì)菌的污染和檢測細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。細(xì)菌污染的檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法PCR檢測真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡真菌污染支原體污染和檢測支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2um，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體支原體污染的檢測相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法（Hoechst33258）PCR方法（即用型細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測PCR試劑盒）病毒的污染和檢測細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡觀察PCR技術(shù)污染的預(yù)防防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。器皿準(zhǔn)備—開始操作前—操作過程中—其他細(xì)節(jié)方面的預(yù)防在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml。必要時(shí)加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B等。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。購入的未滅活血清應(yīng)采取56℃水浴滅活30min的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體滅活。支原體污染的預(yù)防小牛血清是造成支原體初級(jí)污染的主要來源次級(jí)污染源，即已污染支原體的細(xì)胞在污染的傳播中更為重要保證培養(yǎng)細(xì)胞的來源絕對(duì)干凈，同時(shí)應(yīng)做好檢測，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應(yīng)廢棄嚴(yán)禁已知污染了支原體的細(xì)胞進(jìn)入未污染的工作區(qū)域。嚴(yán)格無菌操作，杜絕人為污染。對(duì)每批小牛血清嚴(yán)格檢查，滅活、過濾有利于抑制支原體的污染。