生化過程參數(shù)的檢測和控制概要

2023/9/21第七章生化過程參數(shù)的檢測和控制2023/9/22教學(xué)時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)教學(xué)目的與要求：了解生化過程參數(shù)的分類及生物傳感器的種類及特點(diǎn)，能利用生物傳感器對生化反應(yīng)中的直接參數(shù)進(jìn)行檢測，并通過參數(shù)判斷生產(chǎn)過程是否染菌，掌握雜菌染菌的途徑及挽救；教學(xué)重點(diǎn)：直接參數(shù)的檢測、生產(chǎn)過程中的染菌及其控制；教學(xué)難點(diǎn)：直接參數(shù)的檢測、生產(chǎn)過程中的染菌及其控制。2023/9/23本章主要內(nèi)容第一節(jié)直接參數(shù)的檢測與控制第二節(jié)生物傳感器第三節(jié)生產(chǎn)過程中的染菌及其控制2023/9/24教學(xué)時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)教學(xué)目的與要求：了解生化過程參數(shù)的分類及生物傳感器的種類及特點(diǎn)，能利用生物傳感器對生化反應(yīng)中的直接參數(shù)進(jìn)行檢測，并通過參數(shù)判斷生產(chǎn)過程是否染菌，掌握雜菌染菌的途徑及挽救；教學(xué)重點(diǎn)：直接參數(shù)的檢測、生產(chǎn)過程中的染菌及其控制；教學(xué)難點(diǎn)：直接參數(shù)的檢測、生產(chǎn)過程中的染菌及其控制；2023/9/25

在發(fā)酵工業(yè)中，除了要考慮已接種的微生物本身的特殊需要外，由于產(chǎn)品的要求還應(yīng)適當(dāng)考慮培養(yǎng)基的組成、pH值、溫度、水分、氧氣、雜菌污染等條件。這些條件的變化反映了發(fā)酵過程的動態(tài)。人們在實(shí)踐中，正是通過觀察和控制這些工藝條件從而控制和完成發(fā)酵過程。當(dāng)然，這些條件之間是相互聯(lián)系的、相互影響的，認(rèn)真研究發(fā)酵產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制，并創(chuàng)造所必需的分析和傳感儀表，以提供這些控制發(fā)酵工藝取得成效，顯然也是生化工程的重要課題。2023/9/26生化過程參數(shù)的分類

反映生化過程變化的參數(shù)分為兩大類：一類是可以直接采用特定的傳感器檢測的參數(shù)稱為直接參數(shù)，包括各種反映物理環(huán)境和化學(xué)環(huán)境變化的參數(shù)：如溫度、壓力、流量、攪拌功率、轉(zhuǎn)速、泡沫、黏度、濁度、pH、離子強(qiáng)度、溶解氧和基質(zhì)濃度等。另一類是綜合參數(shù)，包括細(xì)胞生長速率、產(chǎn)物合成速率、呼吸商等。2023/9/27

用于發(fā)酵工業(yè)的傳感器，除了應(yīng)滿足一般測量儀表的要求外，還應(yīng)具有幾個方面的面的特征：（1）傳感器能安裝在發(fā)酵罐內(nèi)耐受高壓蒸汽（120-135℃,30min以上）滅菌處理；（2）傳感器及二次儀表具有長期工作穩(wěn)定性，在1-2周內(nèi)其測量誤差應(yīng)小于5%；2023/9/28（3）最好能在使用過程中隨時(shí)校正；（4）材料不易老化，使用壽命長；（5）傳感器的探頭安裝和使用方便；（6）探頭不易被物料粘住、堵塞；（7）價(jià)格便宜。2023/9/29

第一節(jié)直接參數(shù)的檢測和控制一.溫度檢測和控制嚴(yán)格保持菌種的生長繁殖和生物合成所需的最適溫度，對穩(wěn)定發(fā)酵過程，縮短周期，提高產(chǎn)量，具有重要意義。通?？梢圆捎盟y溫度計(jì)、熱電阻監(jiān)測系統(tǒng)中的溫度。普遍使用的熱電阻有鉑電阻和銅電阻。2023/9/210鉑電阻精度高、穩(wěn)定性好、性能可靠；銅電阻超過100℃時(shí)易被氧化。為了使生物反應(yīng)在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，必須采取措施——在夾套或蛇管內(nèi)通入冷卻水加以控制。發(fā)酵熱的測定(1)通過測量一定時(shí)間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水的進(jìn)出。Q發(fā)酵=GC(T2-T1)/VQ發(fā)酵-----------發(fā)酵熱;C-------冷卻水的比熱G-----------冷卻水的流量;T1T2------進(jìn)出口冷卻水的溫度;V----------發(fā)酵液的體積2023/9/212(2)通過罐溫度的自動控制，先使罐溫達(dá)到恒定，再關(guān)閉自控裝置，測量溫度隨時(shí)間上升的速率S。

Q發(fā)酵=(M1C1+M2C2)S/VM1----------發(fā)酵液重量;M2----------發(fā)酵罐重量;C1----------發(fā)酵液比熱;C2----------發(fā)酵罐材料比熱;S----------溫升速率Q發(fā)酵---------發(fā)酵熱2023/9/213(3)根據(jù)化合物的燃燒值計(jì)算發(fā)酵過程中生物熱的近似值。根據(jù)赫斯定律，熱效應(yīng)決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化的途徑無關(guān)。反應(yīng)的熱效應(yīng)等于產(chǎn)物的生成熱總和減去作用物的生成熱總和，也可以用燃燒熱來計(jì)算熱效應(yīng)，特別對于有機(jī)化合物，燃燒熱可直接測定，所以采用燃燒熱來計(jì)算更合適。2023/9/214

反應(yīng)熱效應(yīng)等于作用物的燃燒熱總和（消耗培養(yǎng)基釋放的能）減去生成物的燃燒熱總和（產(chǎn)物和菌所具有的能），可用下式計(jì)算：(4)測定微生物生長代謝中的耗氧量。

--------發(fā)酵過程中生成的發(fā)酵熱數(shù)量；

---------基質(zhì)完全氧化需氧量與菌體和產(chǎn)物完全氧化需氧量之差，即微生物在生長和代謝過程中所消耗的氧；2023/9/216---------代表微生物呼吸（供氧）反應(yīng)的焓變，若以有效電子轉(zhuǎn)移（物質(zhì)在氧化過程中伴隨著能量釋放所進(jìn)行的電子轉(zhuǎn)移）為基準(zhǔn)，則：其中為有機(jī)化合物氧化時(shí)每轉(zhuǎn)移一個有效電子所平均釋放出的熱量；4為消耗１ｍｏｌＯ２相應(yīng)的有效電子轉(zhuǎn)移數(shù)（當(dāng)1ｍｏｌ葡萄糖2023/9/217完全氧化時(shí)，需要消耗6ｍｏｌ氧氣，相應(yīng)的有效電子轉(zhuǎn)移數(shù)為24，釋放的能量應(yīng)為:所以：

由此可見，通風(fēng)（耗氧）發(fā)酵過程生成的發(fā)酵熱數(shù)量與過程所消耗的氧是成正比。當(dāng)測得發(fā)酵過程中氧的消耗（可根據(jù)氣體分析和通風(fēng)量進(jìn)行計(jì)算得到），就能把發(fā)酵過程中需要移去的熱量計(jì)算出來。2023/9/218

根據(jù)理論推導(dǎo)和試驗(yàn)驗(yàn)證，可以用下式對通風(fēng)發(fā)酵過程生成熱進(jìn)行估算：QH=(0.106~0.124)QO2≈(1/10)QO2QO2----------比耗氧速率(mmolO2/g菌體.h)QH-----------發(fā)酵熱生成的比速(kcal/g菌體.h)

當(dāng)通風(fēng)發(fā)酵出現(xiàn)溶解氧不足時(shí)，有的的微生物能夠進(jìn)行厭氧反應(yīng)。則出現(xiàn):QH>>(0.106~0.124)QO2。如果出現(xiàn)這種情況，就可以得出溶氧不足的結(jié)論。二.pH的檢測和控制pH值可用耐滅菌的玻璃電極和銀-汞參比電極以及pH測量儀表的檢測系統(tǒng)檢測，可連續(xù)指示罐內(nèi)酸堿變化。微生物反應(yīng)過程中pH的變化具有一定規(guī)律。①在微生物細(xì)胞的生長階段，由于所用的微生物菌種不同，相對于接種后的起始pH值有上升或下降趨勢2023/9/220②在生產(chǎn)階段，一般反應(yīng)液的pH值趨于穩(wěn)定，維持在最適合產(chǎn)物形成的范圍。③在微生物細(xì)胞的自溶階段，隨著培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的積累和活躍，微生物自溶，引起培養(yǎng)液中的氨基氮等的增加，致使pH值有上升。引起反應(yīng)液pH值下降的主要原因有：1.培養(yǎng)基中的碳/氮比例不當(dāng)，碳源過多，特別是葡萄糖過量或者中間補(bǔ)糖過多或溶解氧不足，致使糖等物質(zhì)氧化不完全，培養(yǎng)液中有機(jī)酸會大量積累，從而使pH值下降2.消泡油加得過多；3.微生物生理性物質(zhì)的存在，使pH值下降。2023/9/222引起反應(yīng)液pH值上升的主要原因有：1.培養(yǎng)基中的碳/氮比例不當(dāng)，碳源過多，氨基氮釋放會使pH值上升。2.生理堿性物質(zhì)存在。3.中間補(bǔ)料液中氨水或尿素等堿性物質(zhì)的加入過多。1.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的原始pH值，或加入緩沖溶液制成緩沖能力強(qiáng)、pH值變化不大的培養(yǎng)基。2.可在反應(yīng)過程中加入弱酸或弱堿進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)，進(jìn)而合理地控制發(fā)酵條件，也可通過調(diào)整通風(fēng)量來控制pH值。3.進(jìn)行補(bǔ)料，既調(diào)節(jié)了培養(yǎng)液的pH值，又可補(bǔ)充營養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的濃度和減少阻遏作用，進(jìn)一步提高產(chǎn)率。反應(yīng)液中pH值的控制方法2023/9/2244.采用酸性銨鹽作為氮源時(shí)，由于NH4+被利用后，剩下的酸根會引起發(fā)酵液中的pH值下降，在培養(yǎng)液中可加入碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH值。5.根據(jù)pH值的變化可用流加氨水的方法來調(diào)節(jié)，同時(shí)又可把氨水作為氮源供給。6.以尿素作為氮源進(jìn)行流加調(diào)節(jié)pH值。三.泡沫的影響和控制太多的泡沫給反應(yīng)帶來不利的影響1.使反應(yīng)器的裝填系數(shù)減少；2.造成大量逃液，導(dǎo)致產(chǎn)物的損失；3.泡沫“頂罐”有可能使培養(yǎng)基從攪拌的軸封滲出，增加了染菌的機(jī)會。2023/9/2264.由于泡沫的液位變動，以及不同生長周期微生物隨泡沫漂浮，使微生物生長的環(huán)境發(fā)生了變化，影響了微生物群體的效果，增加了微生物群體的不均一性。5.影響了攪拌的正常進(jìn)行，妨礙了微生物的呼吸。6.使微生物提早自溶。7.為了控制泡沫，需加入消泡劑。對產(chǎn)物的提取不利。微生物反應(yīng)過程產(chǎn)生泡沫的原因1.由外界引進(jìn)的氣流被機(jī)械地分散形成2.反應(yīng)過程產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成的泡沫培養(yǎng)基的物理化學(xué)性質(zhì)對泡沫形成的表面現(xiàn)象起決定作用，此外，培養(yǎng)基的溫度、酸堿度、濃度等對過程的泡沫也有一定的影響。培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量越多，反應(yīng)液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久穩(wěn)定。泡沫的控制化學(xué)消泡消泡機(jī)理：1.消泡劑是表面活性物質(zhì)，降低氣泡表面張力，使氣泡破裂2.降低機(jī)械強(qiáng)度（降低液膜的彈性）3.降低膜表面的黏度。天然油脂類、高級醇類、聚醚類、硅酮類、氟化烷烴等2023/9/229生產(chǎn)中的一些用法：(1)通過機(jī)械攪拌，使消泡劑更易于分散在反應(yīng)液中。(2)將消泡劑與載體一起使用，使消泡劑溶于或分散于載體中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡劑時(shí)，以豆油為載體的消泡增效作用明顯。(3)多種消泡劑并用可增強(qiáng)消泡作用。(4)使用乳化劑增強(qiáng)消泡劑的消泡作用，如消泡劑聚氧丙烯甘油用吐溫-80為乳化劑的增效作用可提高1~2倍。

機(jī)械消泡靠機(jī)械強(qiáng)烈振動和壓力的變化，促使細(xì)胞破裂，或借助機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分離回收，從而達(dá)到消泡的作用。機(jī)械消泡的優(yōu)點(diǎn)是不需在發(fā)酵液中加入其他物質(zhì)，減少了由于加入消泡劑所引起的染菌機(jī)會和對后續(xù)分離的影響。但是機(jī)械效果不如化學(xué)消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素，而且它還需要一定的設(shè)備和消耗一定的動力。液位電極控制消泡劑的流加液位電極是根據(jù)空氣與帶有發(fā)酵液的泡沫導(dǎo)電率不同的原理制造。采用雙位式的控制方法，當(dāng)反應(yīng)物液面達(dá)到一定的高度時(shí)，自動打開消泡劑的閥門，當(dāng)液面降回到正常時(shí)，自動關(guān)閉消泡劑的閥門。2023/9/232第二節(jié)生物傳感器傳感器（電極或探頭）：能感受規(guī)定的被測量并按照一定的規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號的器件或裝置，它通常由敏感元件、轉(zhuǎn)化元件及相應(yīng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)和線路組成。生物傳感器：是利用酶、抗體、微生物等作為敏感材料，將所感受的生物體信息轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行檢測的傳感器。2023/9/233生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域臨床檢測：葡萄糖85%，乳酸鹽及其他4%，研究4%。藥物：3%環(huán)境：2%食品：2%機(jī)器人、國防及其他：<1%2023/9/234生物傳感器的結(jié)構(gòu)和原理

生物傳感器的結(jié)構(gòu)一般是在基礎(chǔ)傳感器(電化學(xué)裝置）上再耦合一個生物敏感膜（稱為感受器或敏感元件）。生物敏感膜緊貼在探頭表面上，再用一種半滲透膜與被測溶液隔開。當(dāng)待測溶液中的成分透過半透膜有選擇地附著于敏感物質(zhì)時(shí)，形成復(fù)合體，隨之進(jìn)行生化和電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生普通電化學(xué)裝置能感知的O2、H2、NH4+、CO2等，并通過電化學(xué)裝置轉(zhuǎn)換為電信號生物傳感器的特點(diǎn)1)對被檢測物質(zhì)具有極好的選擇性，噪音低。2)操作簡單，需用樣品少，能直接完成測定。3)經(jīng)固定化處理后，可保持長期生物活性，傳感器可經(jīng)得住反復(fù)使用。4)能在短時(shí)間內(nèi)完成測定。5)不要求樣品具有透明度。6)主要缺點(diǎn)是壽命較短。2023/9/236生物傳感器的種類酶傳感器微生物傳感器免疫傳感器細(xì)胞傳感器組織傳感器生物電子傳感器2023/9/237發(fā)酵工業(yè)中的傳感器的特點(diǎn)1.傳感器能安裝在發(fā)酵罐內(nèi)耐受高壓蒸汽（120~135℃、30min以上）滅菌處理；2.傳感器及二次儀表具有長期工作穩(wěn)定性，在1~2周內(nèi)其測定誤差應(yīng)小于5%；3.最好在使用過程中隨時(shí)校正；2023/9/2384.材料不易老化，使用壽命長；5.傳感器探頭安裝和使用方便；6.探頭不易被物料粘住、堵塞；7.價(jià)格便宜2023/9/239第三節(jié)生產(chǎn)過程中的染菌及其控制生物反應(yīng)過程染菌的分析1.種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象種子培養(yǎng)異常異常的主要表現(xiàn)有菌體生長緩慢、菌絲結(jié)團(tuán)、菌體老化以及培養(yǎng)液的理化參數(shù)變化。發(fā)酵異常主要表現(xiàn)在菌體生長速度緩慢，形態(tài)不粗壯或過早老化，以及糖、氮、pH、泡沫、發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵濃度等理化參數(shù)不正常。2023/9/240染菌的檢查與判斷

在發(fā)酵過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時(shí)采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要手段。

1.顯微鏡檢查法（鏡檢法）對樣品進(jìn)行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征區(qū)別，判斷是否染菌。2023/9/241

如發(fā)現(xiàn)有與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其他微生物的存在，就可斷定為發(fā)生了染菌。此法檢查雜菌最為簡單、最直接，也是最常用的檢查方法之一。必要時(shí)還可進(jìn)行芽孢染色或鞭毛染色。2.肉湯培養(yǎng)法通常用組成為0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化鈉、0.8%蛋白胨、0.4%的1%酚紅溶液（pH7.2）的葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待檢樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37℃和27℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察微生物生長情況，并進(jìn)行鏡檢，判斷是否染菌。常用來檢查培養(yǎng)基和無菌空氣中是否帶菌。2023/9/2433.平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法將待檢樣品在無菌平板上劃線，分別于37℃和27℃下進(jìn)行培養(yǎng)，一般24h后即可進(jìn)行鏡檢觀察,檢查是否有雜菌。有時(shí)為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置于37℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)，使雜菌迅速增殖后再劃線。4.發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法根據(jù)發(fā)酵過程出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象如溶解氧、pH值、排出氣中的CO2含量以及微生物菌體的酶活力等的異常變化來檢查發(fā)酵是否染菌。溶解氧水平異常變化，對于特定的發(fā)酵過程具有一定的溶解氧水平，而且在不同的發(fā)酵階段其溶解氧的水平也是不同的。如果發(fā)酵過程中的溶解氧水平發(fā)生了異常的變化，一般就是發(fā)酵染菌發(fā)生的表現(xiàn)。2023/9/245谷氨酸正常發(fā)酵與異常發(fā)酵溶解氧變化

由于染菌的雜菌的好氧性不同，產(chǎn)生的溶解氧異常的現(xiàn)象也是不同的。當(dāng)雜菌是好氣性微生物，溶解氧的變化是在短時(shí)間內(nèi)下降，直至接近于零，且在長時(shí)間內(nèi)不能回升；當(dāng)雜菌是非好氣性微生物，而生產(chǎn)菌由于受污染而抑制生長，使耗氧量減少，溶解氧升高。排氣中的CO2異常變化，好氣性發(fā)酵排出的氣體中的CO2含量與糖的代謝有關(guān)。對于特定的發(fā)酵過程，工藝確定后，排出的氣體中的CO2含量的變化是有規(guī)律的。2023/9/247染菌后，培養(yǎng)基中糖的消耗發(fā)生變化，引起排氣中CO2含量的異常變化，如雜菌污染時(shí)，糖消耗加快，CO2含量增加，噬菌體污染污染后，糖消耗減緩，CO2含量。還可根據(jù)其他一些現(xiàn)象，如泡沫異常增多、發(fā)酵液的顏色異常變化，代謝產(chǎn)物異常下跌、發(fā)酵周期拖長、黏度異常增加等來判斷染菌。

在眾多的方法中，應(yīng)以無菌試驗(yàn)和平板培養(yǎng)為主，其他方法為輔來進(jìn)行染菌的判斷。無菌試驗(yàn)時(shí)，如果肉湯培養(yǎng)基連續(xù)三次發(fā)生變色反應(yīng)或產(chǎn)生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有雜菌菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。2023/9/249有時(shí)肉湯培養(yǎng)的陽性反應(yīng)不夠明顯，而發(fā)酵樣品的各項(xiàng)參數(shù)確有可疑的染菌反應(yīng)，并經(jīng)鏡檢等其他方法確認(rèn)連續(xù)三次有相同類型的雜菌存在，也應(yīng)該判斷為雜菌。無菌試驗(yàn)期間應(yīng)每六小時(shí)觀察一次無菌試驗(yàn)樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。2023/9/250雜菌染菌的途徑和防治1.種子帶菌及其防治（5%~10%）2.空氣帶菌及其防治（20~30%）3.設(shè)備的滲漏或死角造成的染菌及其防治（10%~25%）4.培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致的染菌（2%~5%）5.噬菌體及其防治2023/9/2512023/9/2522023/9/253噬菌體染菌及其防治對于利用細(xì)菌或放線菌進(jìn)行的發(fā)酵容易受噬菌體的污染，由于噬菌體的感染力非常強(qiáng)，傳播蔓延迅速，且較難防治，對發(fā)酵生產(chǎn)有很大的威脅。噬菌體是一種病毒，直徑0.1μm，可以通過環(huán)境污染、設(shè)備的滲漏或死角、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底、補(bǔ)料過程及操作失誤、菌種帶進(jìn)噬菌體或本身是病源性菌株等途徑而染菌。2023/9/254以谷氨酸生產(chǎn)過程染上了噬菌體為例：初期OD值不上升或回降；

pH值逐漸上升，可到8.0以上，且不再下降或pH值稍下降，停滯在7.0~7.2之間，氨的利用停止；糖耗、升溫緩慢或停止；產(chǎn)生大量泡沫，有時(shí)使發(fā)酵液呈現(xiàn)粘膠狀；谷氨酸的產(chǎn)量很少，增長緩慢或停止；鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)了