腫瘤的基因診斷

腫瘤的分子診斷Molecular

diagnosisoftumors

多基因疾病是指疾病的發(fā)生涉及兩個以上基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的改變。分子診斷是指利用分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的方法，通過檢測基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)的異常，對人類狀態(tài)和疾病做出診斷的方法。

腫瘤的分子診斷是指用分子生物學(xué)手段，通過檢測腫瘤相關(guān)基因的存在，分析腫瘤相關(guān)基因的缺陷、表達(dá)及其功能，以達(dá)到腫瘤診斷的目的。概念一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制

腫瘤自身原因

外因內(nèi)因無限增殖轉(zhuǎn)移空間資源

免疫監(jiān)控

攘外

安內(nèi)同流和污視而不見

腫瘤免疫監(jiān)控失活功能喪失一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身LimitlessreplicativepotentialTissueinvasion&metastasisSustainedangiogenesisInsensitivitytoanti-growthsignalsSelf-sufficiencyingrowthsignalsEvadingapoptosis一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身Self-sufficiencyingrowthsignalsAutocrineloopsOver-expressionofreceptorReceptorisalways‘on’Downstreamsignals一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身ExternaltriggersIntracellulartriggersDeathreceptorsCaspasesSensors(8,9)Executioners(3)Evadingapoptosis一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身Insensitivitytoantigrowthsignals一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身SustainedangiogenesisVEGF(血管內(nèi)皮生長因子)FGF1/2（成纖維細(xì)胞生長因子）ThrombospondinThalidomideAvastin一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身Tissueinvasionandmetastases一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制1、腫瘤自身LimitlessreproductivepotentialHayflickhypothesisLimitednumberofdoublingsTelomeremaintenanceTelomeraseNotalltumorcellshavethispotentialTumorstemcells

(1)免疫監(jiān)視系統(tǒng)要素

識別力攻擊力組成分工

快速反應(yīng)特異反應(yīng)

信息傳遞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（1）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)識別特異反應(yīng)抗原遞呈細(xì)胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（1）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)攻擊效應(yīng)細(xì)胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)

（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生證據(jù)體內(nèi)細(xì)胞突變隨時在發(fā)生，但腫瘤不是隨時發(fā)生。免疫缺陷與腫瘤發(fā)生免疫功能與腫瘤發(fā)展一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生腫瘤監(jiān)控失常原因識別問題腫瘤自身免疫細(xì)胞隱蔽抗原來源與正常細(xì)胞相同抗原遞呈功能缺失無視一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生腫瘤監(jiān)控失常原因殺傷問題腫瘤自身

免疫細(xì)胞殺傷免疫細(xì)胞抑制因子功能異常抑制性免疫細(xì)胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制2、免疫監(jiān)控失調(diào)二、腫瘤的分子診斷內(nèi)容腫瘤標(biāo)志物的檢測

1978年Herberman在美國國立癌癥研究所召開的人類腫瘤免疫診斷會上提出的。由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生的與腫瘤的形成、發(fā)生相關(guān)的物質(zhì),這些物質(zhì)存在于腫瘤細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)、胞膜上或體液中；不存在于正常成人組織而見于胚胎組織,或在腫瘤組織中含量超過正常含量。存在于腫瘤患者的組織、體液和排泄物中，能夠用免疫學(xué)、生物學(xué)及化學(xué)的方法檢測。

原癌基因癌基因病毒癌基因腫瘤抑制基因腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因腫瘤耐藥基因等腫瘤相關(guān)基因細(xì)胞基因組中調(diào)控細(xì)胞增殖和分化且具有能夠使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因，包括病毒癌基因和細(xì)胞癌基因；

癌基因在正常細(xì)胞的基因組中存在不表達(dá)狀態(tài)表達(dá)水平不足以引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化癌基因：定位功能癌基因，產(chǎn)物分泌蛋白生長因子sisPDGFβ鏈跨膜蛋白受體型酪氨酸激酶erbB2,EGF樣受體erbB,EGF受體fms,CSF-1受體膜結(jié)合蛋白G-蛋白非受體型酪氨酸激酶rasp21rassrcpp60src胞漿可溶性蛋白非受體型酪氨酸激酶絲氨酸/蘇氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連接蛋白

Raf，ab1crk,SH2/SH3調(diào)節(jié)蛋白vav,SH2調(diào)節(jié)蛋白胞核蛋白轉(zhuǎn)錄因子Myb，mycfosjunerbA,T3受體表1細(xì)胞癌基因按其產(chǎn)物定位和功能分類能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或抑制細(xì)胞異常增殖的基因

目前研究較多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。抑癌基因基因染色體定位相關(guān)腫瘤基因產(chǎn)物及功能RB13q14RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、結(jié)腸癌p105，控制生長WT11p13WT、橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母細(xì)胞瘤WT-ZFP，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-117p12神經(jīng)纖維瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、雪旺氏細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤GAP，拮抗p21rasBDCC18q21.3結(jié)腸瘤P192,細(xì)胞粘附分子p5317p13星狀細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷狀細(xì)胞肺癌P53控制腫瘤生長erbA17q21ANLLT3受體，含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因表2已確定的幾種抑癌基因野生型P53生物學(xué)活性當(dāng)DNA損傷的時候,P53基因就明顯表達(dá)使細(xì)胞在G1期生長阻滯，促使細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞生長保持DNA完整性包括腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因或腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因腫瘤耐藥基因其表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥的基因。

血小板衍生生長因子（PDGF）表皮生長因子（EGF）

VGF基因等

腫瘤生長因子

腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷目前主要集中在以下幾個方面：腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物腫瘤抗藥基因突變的癌基因腫瘤相關(guān)的病毒基因標(biāo)志分類機(jī)制分子標(biāo)志應(yīng)用于癌癥診斷分子遺傳性染色體易位

t(9；22)，t（14；18），t(11；12)等白血病、淋巴瘤等點突變p53,ERras等胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌等缺失BRCA1，BRCA2，DCC等乳腺癌、結(jié)腸癌改變拼接CD44，muc-1,VLA-4等結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、腦瘤等擴(kuò)增erb-B2,EGFR,N-myc,ras乳腺癌、腦瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤比例改變明膠酶A/TIMP2乳腺癌轉(zhuǎn)移等病毒性病毒轉(zhuǎn)化HPV,HCV,HBV，EBV宮頸癌、肝癌、鼻咽癌等組織性組織分化PSA,PSMA前列腺癌muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3黑素瘤AFP,白蛋白肝癌甲狀腺球蛋白甲狀腺癌NPGP9.5，酪氨酸羥化酶表面活性物質(zhì)等神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤性腫瘤細(xì)胞特征CEA肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌β-HCG黑素瘤等CK-19肺鱗癌端粒酶結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等微衛(wèi)星體等結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等表3

腫瘤基因診斷的分子標(biāo)志及其應(yīng)用

可分為四大類組織特異性基因標(biāo)志腫瘤特異性基因標(biāo)志血管生成因子其它與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子及基質(zhì)蛋白酶及其抑制劑腫瘤轉(zhuǎn)移基因標(biāo)志物組織特異性基因標(biāo)志物指腫瘤組織和/或起源正常組織所特有，在淋巴組織和血細(xì)胞中不存在的。如角質(zhì)蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA等。存在于腫瘤及其起源的正常細(xì)胞中，不存在于其他細(xì)胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等。

突變的癌基因癌基因的突變是癌基因激活的重要方式和途徑。除了見到較大范圍片段的缺失或插人以及染色體轉(zhuǎn)位之外，大多數(shù)情況下，都是少數(shù)核苷酸或單個堿基的突變。.癌基因點突變的檢測單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測技術(shù)等

.腫瘤相關(guān)的病毒基因EB病毒（EBV）人乳頭瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染對于這些腫瘤組織細(xì)胞中相關(guān)病毒基因及其編碼產(chǎn)物的檢測，可以作為這些類型的腫瘤診斷的標(biāo)志。致瘤病毒引起的惡性轉(zhuǎn)化作用引起了人們極大的關(guān)注腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot雜交技術(shù)、Northernblot雜交技術(shù)基因芯片基因測序。腫瘤基因的分子診斷意義

1.腫瘤的早期診斷和篩選2.腫瘤療效監(jiān)測3.腫瘤的預(yù)后判斷4.腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測

腫瘤基因檢測在腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測中

應(yīng)用舉例前列腺癌特異性基因DD3PCA3

DD3PCA3是一種非編碼RNA的基因，定位于9q21～22染色體。它為前列腺癌特異性基因之一，DD3PCA3mRNA僅在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在其它正常組織和癌組織以及細(xì)胞系中均不表達(dá)。DD3mRNA14外顯子擴(kuò)增結(jié)果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤變

)；5～6：BPH(前列腺增生)；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。DD3mRNA13外顯子擴(kuò)增結(jié)果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。DD3mRNA34外顯子擴(kuò)增結(jié)果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。前列腺組織和其他腫瘤組織及癌旁組織DD3mRNA檢測結(jié)果

M：50bpDNA標(biāo)準(zhǔn)；1：LNCaP陽性對照；2：BPH；3：健康男性志愿者；4～10為PCa；11為試劑空白。

外周血DD3mRNA的RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

RT-PCR檢測結(jié)果

44例PCa組中13例可見DD3mRNA陽性結(jié)果(其中B期、C期及D期分別有為0例、2例，11例)。30例BPH患者和18名健康男性志愿者標(biāo)本中均未檢出DD3mRNA。外周血DD3mRNA的巢式RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

M：50bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：LNCaP陽性對照；2：陰性對照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；5～8：未治療的PCa；9：試劑空白巢式RT-PCR檢測結(jié)果44例PCa組中21例可見DD3mRNA陽性結(jié)果(其中B期、C期、D期分別有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未見陽性結(jié)果兩種方法對PCa患者外周血DD3mRNA檢出率比較RT-PCR巢式RT-PCR+-+13