香港海鷗形菌病原學特征及分子分型

香港海鷗形菌病原學特征及分子分型

香港的海鷗菌(。11.1儀器和試劑1.1.1高速離心、溫度培養(yǎng)箱、儀器和儀器MX3005P熒光定量PCR儀為美國STRATAGNE公司產品,Eppendorfcentrifuge5417R小容量高速離心機由德國公司提供,恒溫培養(yǎng)箱由德國Memert公司提供,Bio-RADCHEF-DRⅢSystem核酸脈沖場電泳系統(tǒng)、Bio-RADGelDoc凝膠成像系統(tǒng)、BioNumerics6.0軟件分析系統(tǒng),Densimat電子比濁儀由美國公司提供。1.1.2生物酶試劑及藥物反應條頭孢哌酮由SIGMA公司提供,麥康凱瓊脂和微量生化管由北京陸橋技術有限責任公司提供,氧化酶、觸酶試劑、API20NE生化反應條由法國生物梅里埃公司提供,藥敏紙為OXOID生物試劑公司產品。TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl1.1.3實驗中使用的培養(yǎng)基改良麥康凱平板(CMA):普通麥康凱平板中加入16mg/L頭孢哌酮1.2樣本來源1.2.1樣品的采集選擇深圳市東、西部2家農貿市場、1家商場采集草魚82份、鳙魚120份、塘虱魚40份、鯽魚18份、鯉魚13份、鱸魚34份、武昌魚16份、鯪魚6份共計樣品329份,所采樣獨立包裝、室溫狀態(tài)即時送檢。1.2.2腹瀉病人的管理在9家感染性腹瀉哨點醫(yī)院選擇了北大深圳醫(yī)院、南山醫(yī)院、西鄉(xiāng)醫(yī)院3家醫(yī)院腸道門診就診的腹瀉病人,統(tǒng)一登記流行病學調查表,內容包括一般情況、腹瀉特征、外出旅游史和近期飲食情況等。其中北大深圳醫(yī)院307份,南山醫(yī)院212份,西鄉(xiāng)醫(yī)院60份標本。1.3方法1.3.1棉施工子的采集魚類樣本體表用75%酒精棉球消毒,無菌條件下用剪刀打開腹腔,取出完整的動物腸道,分別剪斷動物的中腸和后腸,將棉拭子插入腸道,旋轉一圈,采集內容物。采樣后的棉拭子直接涂布CMA平板,每個樣本涂布2塊平板;腹瀉病人標本,無菌棉簽采集新鮮糞便標本直接劃線接種于CMA平板,上述平板均置37℃培養(yǎng)24～48h。1.3.2生化鑒定及觸酶試驗從CMA培養(yǎng)基上挑取無色、透明、扁平的微小菌落穿刺TSI,37℃培養(yǎng)24h后,TSI反應陰性(仍保持原來顏色)的菌株,再接種普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h后,用API20NE進行生化鑒定,同時挑取其普通瓊脂平板上的單個菌落進行氧化酶及觸酶試驗,符合香港海鷗形菌生化特性的則判定為香港海鷗形菌。1.3.3體外抗菌藥物選擇臨床常用的24種抗生素用K-B法做藥敏試驗,24種抗生素為氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻吩、頭孢噻腭、頭孢哌酮、頭孢吡腭、頭孢曲松、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈啶酸、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、甲氧芐啶、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、美洛培南、亞胺培南、呋喃妥因。1.3.4模板dna的制備經GenBank比對確定香港海鷗形菌16SrRNA高保守區(qū),設計特異性PCR鑒定引物用接種環(huán)挑取生化試驗符合的菌落若干,于100μl滅菌蒸餾水中制備懸液,振蕩混勻,100℃煮沸5min,然后12000rpm/min離心2min,取上清液作為模板。以香港海鷗形菌浙江株模板DNA為陽性對照,并以去離子水為陰性對照。熒光PCR采用25μl反應體系,每個反應中含10×buffer2.5μl、MgCl1.3.5pfga的分子分類.3.5.11.3.5.2.懸掛細菌懸液1.3.5.3.橡膠塊的制備1.3.5.酶切滌綸纖維在mlep管中的配制用刀片切下寬約2mm的膠條至1.5mlEP管中,用SpeⅠ(50U)于37℃水浴中酶切3h(按ENB公司產品說明書進行配液)1.3.5.6電泳1.3.5.7染色和洗膠1.3.5.8圖像1.3.5.9分析22.1發(fā)揮塘魚、魚和魚的陽性率采集檢測的329份淡水魚樣品中,共檢出香港海鷗形菌7株,陽性率為2.13%。其中塘虱魚的陽性率最高為7.50%(3/40),鳙魚的陽性率為2.50%(3/120),草魚的陽性率為1.22%(1/82),其它淡水魚未檢出。腹瀉病人共檢測579份,未檢出香港海鷗形菌。2.2生化指標檢測香港海鷗形菌在三糖鐵斜面生長,生化反應為斜面和底層均為紅色,氧化酶、觸酶試驗陽性,硝酸鹽還原試驗、精氨酸雙水解酶試驗、脲酶試驗為陽性,其余的生化試驗均為陰性2.3熒光pcr的結果7株香港海鷗形菌生化反應陽性的,熒光PCR結果均為陽性。7株陽性菌株熒光PCR結果見圖1。2.4頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松耐藥結果7株香港海鷗形菌24種抗生素藥敏結果為,對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻吩、頭孢噻腭、頭孢哌酮、頭孢曲松耐藥,頭孢西丁中介,其余的均為敏感。2.5香港海鷗形菌株的篩選PFGE分子分型結果表明7株香港海鷗形菌基因型差異明顯,是不同型別的香港海鷗形菌株,不具有同源性,結果見圖2和圖3。LH1、LH2、LH3從鳙魚中分出,LH12、LH13、LH22從塘虱魚中分出,LH21從草魚中分出。3香港海鷗形菌檢測結果香港海鷗形菌為一種新發(fā)現可致社區(qū)性腸胃炎和旅行者腹瀉的病原菌,是一種食源性病原菌,會引起食物中毒,由于它是條件致病菌,目前在臨床和流行病學上尚未得到重視和深入的研究。本次通過對深圳市淡水魚和腹瀉病人的調查,結果顯示329份淡水魚分屬8個不同的魚種,1株從草魚中檢出,陽性率為1.22%(1/82),3株從鳙魚中檢出,陽性率為2.5%(3/120),3株從塘虱魚中檢出,陽性率為7.5%(3/120),其余5類未檢出,總的陽性率為2.12%。579份腹瀉病人標本未分離到。7株香港海鷗形菌生化反應陽性的,熒光PCR結果均為陽性。7株香港海鷗形菌用24種抗生素做藥敏試驗,對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻吩、頭孢噻腭、頭孢哌酮、頭孢曲松耐藥,頭孢西丁中介,其余的均為敏感。7株香港海鷗形菌PFGE分子分型結果其基因表型差異明顯,證明它們分別是不同型別的香港海鷗型菌菌株,不具有同源性目前有很多香港海鷗形菌檢測方法報道,但都是對傳統(tǒng)方法和普通PCR方法的報道,熒光PCR和PFGE方法報道幾乎很少。本文通過這次調查建立了一套完整成熟的香港海鷗形菌檢測方法,包括傳統(tǒng)的分離鑒定、熒光PCR的快速檢測和PFGE的分子分型。尤其熒光PCR檢測方法優(yōu)點較為突出,其耗時短、靈敏度高、特異性強、重復性好,而且易于操作,只需要2h,是目前快速診斷的金標法。實時熒光PCR方法成功應用于食源性致病菌的檢測,具有快速、特異性強和靈敏性高的特點,可作為食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置和重大活動食品安全保障工作的有效技術支撐。藥敏試驗對臨床診治有一定的指導作用,為該菌臨床學研究的深入提供了可靠的理論依據。PFGE分子分型技術的建立,為香港海鷗形菌的分子分型提供一定的幫助,了解本地區(qū)主要流行菌型,預測該菌的流行趨勢,為應對食源性疾病突發(fā)事件和水產品安全問題做好技術儲備。1.3.4.1.pcr索引設計1.3.4.2.dns的制備1.3.4.蛋白膠塊的制備參照株為H9812,參照美國CDC公布的H9812分子量標準株的PFGE分子分型標準方法。血平板劃線37℃培養(yǎng)24h,無纖維棉簽沾取細菌到2ml細菌懸浮液中,用Densimat電子比濁儀調菌液到4.0。取200μl菌液并加入10μl蛋白酶K(20mg/ml),再與等體積預熔的1%SeakemGold瓊脂糖(含1%SDS)溶液混勻后制備膠塊。將膠塊移入Screw-cap管中,用含0.1mg/ml蛋白酶K的細胞裂解液在54℃,170轉/min水浴搖床中孵育2h,分別15ml雙蒸水和TE洗滌各2次和4次。1.3.5.bio-radgeldoc凝膠成像系統(tǒng)成相電泳膠條包埋于1.5×TEB配制1%SeakemGold瓊脂糖,冷卻30min后放入CHEF-DRⅢ型脈沖場電泳儀進行電泳。電泳參數:電泳緩沖液:0.5×TEB,脈沖時間6.8～35.4s,1