流式triton x100破膜染色實(shí)驗(yàn)步驟

流式tritonx100破膜染色實(shí)驗(yàn)步驟一、溶液與試劑注：利用反滲透去離子水(RODI)或同等級(jí)別的水制備溶液。1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：配制1L的1XPBS：添加100ml10XPBS(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=12528"#12528)至900ml水，然后將其混合。4%甲醛，無(wú)甲醇(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=47746"#47746)細(xì)胞通透緩沖液：購(gòu)買(mǎi)即用型(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=39487"#39487)或者通過(guò)添加30μlTriton?X-100至10ml抗體稀釋緩沖液來(lái)制備10ml。4°C保存?？贵w稀釋緩沖液：購(gòu)買(mǎi)即用型流式細(xì)胞術(shù)抗體稀釋緩沖液(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=13616"#13616)，或在100ml1xPBS中溶解0.5g牛血清白蛋白(BSA)(HYPERLINK"/product/productDetail.jsp?productId=9998"#9998)來(lái)制備0.5%BSAPBS緩沖液。4°C保存。推薦的二抗：要檢測(cè)未偶聯(lián)的抗體，請(qǐng)選擇與您的一抗（例如兔）的宿主物種匹配的二抗。HYPERLINK"/browse/flow-cytometry/secondary-antibodies?N=4291883758+4291883759+102287+4294956287"\t"/learn-and-support/protocols/_blank"點(diǎn)擊此處以獲取被批準(zhǔn)用于流式細(xì)胞術(shù)的二抗的最新列表。二、固定與透化注：固定前，應(yīng)分離貼壁細(xì)胞或組織，使它成為單細(xì)胞懸浮液。注：理想的離心條件根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和試劑容量有所不同。一般，1-5分鐘150-300g將足以使細(xì)胞沉淀下來(lái)。注：如果使用全血，則需在固定前裂解紅細(xì)胞并通過(guò)離心分離來(lái)洗滌。注：如果表位被甲醛和/或Triton?X-100破壞，可以在固定前添加靶向CD標(biāo)記物或其他胞外蛋白的抗體。在固定和透化過(guò)程期間，這類(lèi)抗體將保持與目的靶標(biāo)結(jié)合。如果您不確定，請(qǐng)進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀下來(lái)，移除上清液。按每100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞大約100μl4%甲醛重懸細(xì)胞?；靹蛞越怆x沉淀物并防止各個(gè)細(xì)胞交聯(lián)。室溫(20-25°C)固定15分鐘。通過(guò)離心用過(guò)量1XPBS洗滌。將上清液棄于合適的廢液缸中。在每一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞約100μl細(xì)胞透化緩沖液中重懸細(xì)胞。在室溫孵育10分鐘。繼續(xù)進(jìn)行染色或?qū)⒓?xì)胞在PBS中-4°C保存過(guò)夜。三、免疫染色注：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或備選方法計(jì)數(shù)細(xì)胞。將所需數(shù)目的細(xì)胞分裝入試管或小孔中。（通常，每次檢測(cè)用5x105至1x106個(gè)細(xì)胞）。將細(xì)胞離心，棄去清液。在100μl稀釋的一抗中重懸細(xì)胞，這種一抗按建議的稀釋度或如通過(guò)滴定所確定那樣以抗體稀釋緩沖液配制。室溫(20-25°C)孵育1小時(shí)。在抗體稀釋緩沖液或1XPBS中通過(guò)離心洗滌。棄去上清液。重復(fù)。如果使用直接偶聯(lián)抗體，則跳到步驟9。在100μl稀釋的熒光素偶聯(lián)的二抗（按建議的稀釋比例用抗體稀釋緩沖液制備）中重懸細(xì)胞。在室溫(20