活性污泥脫氫酶活性檢測(cè)方法的比較與優(yōu)化

活性污泥脫氫酶活性檢測(cè)方法的比較與優(yōu)化

采用分光光度法測(cè)定脫氫酶活性（突變）時(shí)使用的主要?dú)鋫€(gè)體主要是氯仿三甲基四羧紫（ttc）、碘硝基四氮唑蘭（int）和亞甲基藍(lán)。1材料和方法1.1菌懸液的制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物(37℃振蕩培養(yǎng)18h左右,離心后用生理鹽水制成一定濃度的菌懸液);好氧污泥(均取自污水廠二期好氧中段),厭氧污泥(均取自ABR第二格中層)。1.2氯化三苯基四氮唑tt-ldbTris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH=8.4):稱取6.057g三羥甲基氨基甲烷加入20mL1.0mol/L的HCl,再定容至1L。TTC溶液(0.4%):稱取1g氯化三苯基四氮唑,溶于蒸餾水中,用250mL定容瓶定容。INT溶液(0.2%):稱取200mg碘硝基四氮唑紫,加熱溶于蒸餾水中,用100mL棕色容量瓶定容?？箟难?0.7%):使用前臨時(shí)配制。1.3ttc-脫氫酶活性測(cè)定具體參照《環(huán)境工程微生物檢驗(yàn)手冊(cè)》1.4脫氫酶活性測(cè)定1.4.1trs-hcl-pcr反應(yīng)配制濃度分別為50mg/L(0.099μmol/mL)、100mg/L(0.198μmol/mL)、200mg/L(0.395μmol/mL)、400mg/L(0.791μmol/mL)、800mg/L(1.582μmol/mL)的INT溶液。取6支10mL離心管,按濃度從低到高的順序,分別加入INT溶液0.3mL,其中第6支離心管為空白(加0.3mL純水),每支離心管中各加入Tris-HCl緩沖液1.5mL、0.7%抗壞血酸溶液0.2mL。混勻后置于37℃恒溫水浴培養(yǎng)箱中,暗處振蕩培養(yǎng)30min,加入37%甲醛1mL終止反應(yīng);5000r/min離心5min輕輕棄去上清液后,加入5mL甲醇,混合攪拌均勻,繼續(xù)在37℃下暗處振蕩萃取10min,5000r/min再離心5min,取上清液在485nm處測(cè)定吸光度A,由此得到INT-A標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.2樣品處理和酶反應(yīng)向10mL離心管中依次加入活性污泥混合液0.3mL、Tris-HCl緩沖液1.5mL、0.2%INT溶液1mL(空白管加入1mL純水)。迅速將制備完成的樣品放入37℃水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30min,加入37%甲醛1mL終止酶反應(yīng);5000r/min離心5min輕輕棄去上清液,加入5mL甲醇,混合攪拌均勻,繼續(xù)在37℃下暗處振蕩萃取10min,4000r/min再離心5min,取上清液在485nm處測(cè)定吸光度,查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脫氫酶活性值。2結(jié)果與討論2.1培養(yǎng)方法對(duì)脫氫酶活性的測(cè)定值的影響2.1.1脫氫酶活性的測(cè)定將枯草芽孢桿菌菌懸液按梯度濃縮后,代替活性污泥進(jìn)行脫氫酶活性的測(cè)定。除培養(yǎng)時(shí)分別采用開蓋振蕩培養(yǎng)(氧氣充足)和密閉靜置(模擬缺氧條件)培養(yǎng)外,其余試劑的加量和處理方法均參照常規(guī)方法,試驗(yàn)結(jié)果見表1。2.1.2培養(yǎng)條件對(duì)鑒定結(jié)果的影響分別采用不同品種的活性污泥,包括枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、厭氧泥、好氧泥,同一樣品在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行DHA的測(cè)定,結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,采用TTC法時(shí),培養(yǎng)條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響顯著,總體看來,密閉靜置培養(yǎng)的測(cè)定結(jié)果明顯高于開蓋振蕩培養(yǎng)結(jié)果,而不同培養(yǎng)方式對(duì)INT法的測(cè)定結(jié)果基本沒有影響。該現(xiàn)象可能與TTC、INT兩種物質(zhì)具有不同的氧化還原電位有關(guān),氧化還原電位越低與電子的親和力越強(qiáng),與氧競(jìng)爭(zhēng)電子的能力越強(qiáng),還原反應(yīng)時(shí)氧的干擾作用越小。TTC的氧化還原電位較高(+490mV),INT的氧化還原電位較低(+90mV),使得在用TTC檢測(cè)污泥脫氫酶活性時(shí),如果不采用除氧步驟,空氣中存在的氧氣會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大的干擾,而INT檢測(cè)污泥脫氫酶活性實(shí)驗(yàn)則可在有氧條件下進(jìn)行。在密閉靜置培養(yǎng)條件下(一定程度上排除氧氣的干擾),DHA測(cè)定值與菌液濃度的關(guān)系不呈線性,可能也與培養(yǎng)過程中溶液中存在的溶解氧有關(guān)。在目前的試驗(yàn)條件下,實(shí)驗(yàn)過程中要完全消除氧氣干擾難度較大,同時(shí)考慮到TTC法需在高溫下進(jìn)行萃取,操作較復(fù)雜,最終選擇了INT法進(jìn)行后續(xù)研究。2.2乙醇-dmso萃取當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)菌培養(yǎng)物代替活性污泥進(jìn)行DHA檢測(cè)時(shí),按文獻(xiàn)方法但用二甲亞砜(DMSO)作為萃取劑時(shí),由于DMSO的密度較大(約為1.1g/cm經(jīng)過比較,結(jié)果表明以DMSO與乙醇相同體積混合后作為萃取劑,既能達(dá)到降低萃取液密度的目的,又能獲得滿意的萃取效率,充分混勻后常溫靜置5~10min就能萃取完全。2.3脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果分別采用枯草芽孢桿菌菌懸液、好氧污泥、厭氧污泥對(duì)污泥濃度與DHA測(cè)定值的相關(guān)性進(jìn)行了試驗(yàn),結(jié)果見圖1~3。從試驗(yàn)結(jié)果看,采用INT法測(cè)定脫氫酶活性(DHA)時(shí),DHA測(cè)定值與污泥濃度之間具有良好的線性關(guān)系。同時(shí)在試驗(yàn)中也注意到測(cè)定厭氧污泥脫氫酶活性時(shí),由于反應(yīng)產(chǎn)物濃度過高,受溶劑量的限制,容易出現(xiàn)產(chǎn)物萃取不完全,測(cè)定結(jié)果偏低的情況,此時(shí)應(yīng)加大稀釋倍數(shù),盡量控制吸光度值在曲線范圍之內(nèi)(樣品檢測(cè)時(shí)OD值不宜超過3.0)。2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鑒定酶促氧化的影響用枯草芽孢桿菌菌懸液代替活性污泥,測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的脫氫酶活性值,本次試驗(yàn)采用的培養(yǎng)時(shí)間為20min及30min,結(jié)果見圖4。可見,培養(yǎng)時(shí)間為20min時(shí)DHA測(cè)定值結(jié)果明顯高于30min培養(yǎng)時(shí)。發(fā)現(xiàn)該酶促反應(yīng)的速率似乎并不是恒定的,前期較快,但隨著時(shí)間推移逐漸下降。這與TTC法相關(guān)參考文獻(xiàn)2.5在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，保持原劑的選擇因采用文獻(xiàn)2.5.1離心穩(wěn)定性測(cè)定參照TTC法,用連二亞硫酸鈉(保險(xiǎn)粉)作為還原劑。結(jié)果表明,用連二亞硫酸鈉能夠迅速將INT還原成紅色還原產(chǎn)物,但在反應(yīng)后離心去上清時(shí)出現(xiàn)紅色產(chǎn)物有部分漂浮在液面上,且離心后沉淀非常松散,不能把產(chǎn)物與上清液有效分離的情況,不能滿足檢測(cè)精度要求(TTC法由于不需要離心,故不存在這個(gè)問題)。2.5.2酸作還原劑試驗(yàn)結(jié)果將枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)液離心后,配制成高濃度菌懸液(菌絲體量約占總體積的20%),代替7%抗壞血酸作還原劑,試驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5?？梢?用高濃度枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)物還原定量加入的INT后,吸光度值與INT加入量之間呈良好的線性關(guān)系;嘗試取曲線上的點(diǎn)以單標(biāo)的形式,參照曲線制作時(shí)的試驗(yàn)條件測(cè)定吸收值,計(jì)算結(jié)果與實(shí)際濃度的偏差在10%以內(nèi),表明用高濃度的枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)物代替化學(xué)還原劑是可行的。3提取方法的選擇(1)試驗(yàn)結(jié)果證明,檢測(cè)過程中氧氣的存在對(duì)TTC法檢測(cè)結(jié)果有嚴(yán)重干擾。相對(duì)于TTC法,INT法雖然存在檢測(cè)成本相對(duì)較高的缺點(diǎn),但可在有氧環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè),且檢測(cè)過程更易于控制。因此在當(dāng)前檢測(cè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格除氧實(shí)施起來有一定難度的情況下,采用INT法無疑是更可行的選擇。(2)試驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)時(shí)間對(duì)DHA測(cè)定結(jié)果有較大影響,因此采用固定的反應(yīng)時(shí)間很有必要,目前采用的培養(yǎng)時(shí)間為30min。且當(dāng)吸光度偏高時(shí)應(yīng)盡量采用稀釋的方法進(jìn)行測(cè)定,而