土忍翹薇合劑對大鼠細胞色素p450酶活力和mrna表達的影響

土忍翹薇合劑對大鼠細胞色素p450酶活力和mrna表達的影響

細胞色素p450（cytochromep450，cyp450）是體內(nèi)各種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的主要代謝酶。這種酶的變化可以干擾相關(guān)物質(zhì)的代謝環(huán)節(jié)，并改變生物效應(yīng)。土忍翹薇成方于已故老中醫(yī)陳蘇生,由土茯苓、忍冬藤、連翹和白薇組成,在陳蘇生醫(yī)案1材料表面1.1實驗中心雄性8周SD大鼠20只,體質(zhì)量220~250g,購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2015-0001,動物使用許可證號:SYXK(浙)2015-0009,飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,室溫控制在(25±3)℃,常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。1.2儀器、試劑和儀器XEVOTQ-Smicro質(zhì)譜儀,配備電噴霧離子源(美國Waters科技有限公司);ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters科技有限公司);DU640核酸和蛋白分析儀(美國Beckman儀器有限公司);MyCycler熱循環(huán)儀(美國Bio-Rad有限公司);7500RT-PCR儀(美國AppliedBiosystems科技有限公司)。1.3aldrity公司咪達唑侖(批號:171250-200401)、安非他酮(批號:100671-201001)和地西泮(批號:171225-200903)購自中國食品藥品檢定研究院;非那西丁(批號:STBB2177M9)、氯唑沙宗(批號:SLBD9318V)和甲苯磺丁脲(批號:078K0725)購自美國Sigma-Aldrich公司,純度均>98%;咪達唑侖注射液(批號:20150607)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司;乙腈、甲酸為色譜純,其余試劑均為分析純;RNA提取試劑盒購自美國羅氏診斷有限公司;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit購自美國ThermoScientific公司;PowerSYBRGreenPCRMasterMix試劑購自美國AppliedBiosystems公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。土茯苓(RhizomaSmilacisGlabrae)(批號:1612118)和白薇(CynanchumatratumBunge)(批號:160626)購自衢州南孔中藥有限公司;忍冬藤(CaulisLoniceraeJaponicae)(批號:161225)和連翹(Forsythiasuspensa)(批號:161128)購自杭州華東醫(yī)藥藥材參茸公司。上述飲片經(jīng)林崇良藥師鑒定,符合2015年版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)定。參照陳蘇生醫(yī)案2方法2.1采用cock領(lǐng)袖法測定了土壤溶菌對大鼠cyp450酶活性的影響2.1.1持續(xù)14d12只SD大鼠隨機分對照組和實驗組,實驗組每日灌胃土忍翹薇合劑6mL/kg,對照組灌胃等劑量純凈水,給藥持續(xù)14d。于第15天同時灌胃給予非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗及咪達唑侖各5mg/kg,并在給予探針藥后0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7h于大鼠尾靜脈取血0.3mL置于肝素化EP管中,8000r/min離心10min,分離得100μL血漿置于-20℃冷凍備用。2.1.2探針藥血藥濃度檢測取100μL血漿樣品,加入含有濃度為100ng/mL地西泮和甲苯磺丁脲(內(nèi)標)的乙腈溶液200μL沉淀血漿蛋白,渦旋30s后13000r/min離心10min,取上清液200μL于進樣瓶中,設(shè)定2μL進樣檢測探針藥血藥濃度。2.1.3電噴霧離子源參照文獻[9]并進行優(yōu)化。CORTECSTMUPLCC18(2.1mm×100mm,1.6μm);流速0.4mL/min;柱溫40℃;流動相A(0.1%甲酸),B(乙腈),梯度洗脫:0~1.5min(10%~70%B),1.5~2.2min(70%~70%B),2.2~2.5min(70%~10%B),2.5~4.0min(10%~10%B)。ESI(電噴霧離子源),源溫度150℃,脫溶劑氣溫度500℃,錐孔氣流量50(L/Hr),脫溶劑氣流量1000(L/Hr),氬氣流量0.15mL/min。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)進行定量,各探針藥和內(nèi)標的檢測參數(shù)如表1所示。2.1.4血藥濃度標準曲線的繪制非那西丁和氯唑沙宗在5~5000ng/mL血藥濃度范圍,安非他酮和咪達唑侖在5~1000ng/mL血藥濃度范圍制備標準曲線并進行方法學(xué)考察。血樣經(jīng)2.1.2項下處理后根據(jù)2.1.3項下的檢測方法進樣得到峰面積,運用建立的標準曲線換算得到探針藥的濃度。2.2根據(jù)rt-pcr法，土壤溶劑對大鼠cyp450酶mrna的影響2.2.1土忍翹薇混合物8只SD大鼠隨機分為對照組和實驗組,實驗組每日灌胃6mL/kg土忍翹薇合劑,對照組灌胃等劑量純凈水,給藥持續(xù)14d。最后一次給藥后24h處死,迅速取肝臟組織于-80℃冰箱保存。2.2.2rna提取純度的nm測定按試劑盒說明書提取肝臟總RNA,于260nm和280nm測定吸光度,兩者比值介于1.8和2.0之間視為提取的RNA純度合格,同時根據(jù)260nm吸光值將RNA濃度調(diào)整至1μg/μL,用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。2.2.3ribo水生植物取1μg總RNA,分別加入1μLrandomhexamerprimer、4μL5×Reactionbuffer、1μLRiboLockRNaseInhibitor、2μLdNTPmix、1μLRebertAidM-MuLVTranscriptase和10μLnuclease-freewater至終體積20μL。反轉(zhuǎn)錄條件為25℃5min,42℃60min,最后70℃5min終止反應(yīng),得到的cDNA產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)或于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4pcr反應(yīng)條件取2μLcDNA產(chǎn)物,分別加入10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix、20mmol/L上下游引物各0.5μL、7μLnuclease-freewater,使反應(yīng)終體積為20μL。PCR反應(yīng)條件為:50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,運行40個循環(huán)。測定樣本CT值后,采用22.3實驗數(shù)據(jù)和方法采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,藥動學(xué)參數(shù)使用DAS2.0軟件計算,組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1血藥濃度測定4種探針藥和內(nèi)標色譜圖如圖1所示,非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗、咪達唑侖與內(nèi)標地西泮及甲苯磺丁脲的保留時間分別為1.76、1.67、1.89、1.77、2.23和2.09min。血漿中4種探針藥最低檢測限均為5ng/mL,在線性范圍內(nèi)4種探針藥日內(nèi)和日間精密度相對標準偏差(relativestandarddeviation,RSD)均小于8%,相對回收率均在95%~101%,絕對回收率均大于80%。本方法具有較高專屬性,適用于同時測定大鼠血漿中4種探針藥的濃度。采集的血樣運用建立的方法進行血藥濃度測定,繪制平均藥時曲線圖和計算藥動學(xué)參數(shù),如圖2與表3所示。與對照組比較,實驗組大鼠連續(xù)灌胃土忍翹薇合劑14d后,非那西丁的清除率(Cl3.2組rna表達比較響如圖3所示,實驗組大鼠CYP1A2和CYP3A1mRNA表達分別上調(diào)為對照組的2.26倍和1.94倍(P<0.05),而CYP2B1與CYP2E1mRNA表達2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4土忍翹薇制劑不同物種之間CYP450基因序列具有一定相似性,經(jīng)比對,大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1與人CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4mRNA序列分別具有70%、74%、81%、73%同源性觀察對應(yīng)底物的藥動學(xué)參數(shù)可以評估CYP450酶的活力人體內(nèi)CYP1A2主要在肝臟分布,約占CYP450總量的13%左右,負責(zé)約二十多種藥物的體內(nèi)代謝,包括華法林、茶堿、氯氮平和氟哌啶醇等窄治療窗藥物近十多年,本院一直用土忍翹薇方防治糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng),患者獲益明顯。土忍翹薇方取土茯苓除濕通絡(luò)利關(guān)節(jié)、忍冬藤清熱解毒通經(jīng)、連翹清熱解毒散結(jié)及白薇清虛實兩熱等作用,以中醫(yī)藥的理論分析,本方組合符合糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)的防治思路,但如何使用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論對土忍翹薇方的藥理作用進行解釋,是目前面臨的難題。本研究發(fā)現(xiàn),土忍翹薇合劑能同時增強CYP3A1酶活力和mRNA表達,在人體內(nèi)CYP3A4同時也是外源性激素(糖皮質(zhì)激素)的代謝酶,CYP3A4上調(diào)可以下調(diào)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的濃度,使其對垂體分