益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)糖尿病大鼠肝臟p450的影響及與血糖血脂的關(guān)系

益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)糖尿病大鼠肝臟p450的影響及與血糖血脂的關(guān)系

細(xì)胞色素p450酶（cyp450）是一個(gè)重要的藥物-代謝酶，能加速藥物的氧化、還原和水解反應(yīng)，對(duì)內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝起著非常重要的作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1熒光定量pcr、熒光定量pcr、熒光定量pcr丹蛭降糖膠囊(DJC),安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物制劑中心提供,由太子參、丹皮、地黃、菟絲子、澤瀉、水蛭組成(0.35克/粒),鹽酸吡格列酮(杭州中美華東制藥有限公司),鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):s0130),DL2000DNAMarke、6×Loadingbuffer(TaKaRa公司,批號(hào):B7301A),Trizol(Invitrogen公司批號(hào):14105)、引物合成(Invitrogen),DEPC(Sigma公司,批號(hào):20130119215),熒光定量PCR試劑盒(Thermo公司,批號(hào):00145205),QuantiFastSyBrGreenPCRkit(Qiagen公司,Cat.No.204054),核酸染料(賽百盛GoldView公司,批號(hào):130618),氯仿、無水乙醇、異丙醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20120320、20120320、20120210)。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)健康SD雄性大鼠55只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):scxk(皖)2013。大鼠一般狀態(tài)良好,毛發(fā)茂盛有光澤,進(jìn)食及活動(dòng)正常,反應(yīng)靈敏。1.1.3儀器、設(shè)備和儀器美國(guó)強(qiáng)生血糖儀(穩(wěn)豪型),全自動(dòng)生化儀(日本株式會(huì)社,型號(hào):日立7600),西門子公司生產(chǎn)特定蛋白儀。普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):K960)、電泳儀(TanonEPS300型)、低速迷你離心機(jī)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司LX300型)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司JW-3021HR)、萬分之一電子天平、微量移液器(德國(guó)Eppendorf)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ThermoPIKOREAL96)、微孔板迷你離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司,型號(hào):MINI-P25)、PIKOPlateIlluminator(Thermo公司)。1.2方法1.2.1糖尿病大鼠造模及分組取SD雄性大鼠55只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,隨機(jī)選出9只作為健康對(duì)照組,予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(蛋白質(zhì)16%、脂肪8%、碳水化合物50%)。其余作為實(shí)驗(yàn)組,給予高脂飼料進(jìn)食(蛋白質(zhì)14%、脂肪25%、碳水化合物51%,膽固醇5%)。高脂飼料喂養(yǎng)4周后,一次性腹腔注射STZ35mg/kg(臨用前以pH4.4的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制),120h后尾靜脈采血,以隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為造模成功。造模成功后,將成模的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組9只,吡格列酮組9只,DJC高劑量組10只,DJC低劑量組9只。按人與大鼠單位體質(zhì)量折算系數(shù)給予吡格列酮組給予(10mg/kg)灌胃,DJC高劑量組為(1.08g/kg),DJC低劑量組為(0.54g·kg1.2.2熒光定量pcr反應(yīng)Realtime-PCR檢測(cè)大鼠肝臟組織P450mRNA:大鼠麻醉后迅速取出肝臟,立即放入-80℃的液氮罐中保存。按照Trizol試劑說明書提取大鼠肝臟組織總RNA。在0.2mLEP管中,加入總RNA(3μg)、10μmol/LOligo(dT)1μL、DEPC水補(bǔ)足至12μL,輕輕混勻、點(diǎn)動(dòng)離心;在PCR儀上65℃加熱5min后,立即冰浴3min;再依次加入5×ReactionBuffer4.0μL、10mmol/LdNTPMix2μL、RNA酶抑制劑1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1μL;42℃反應(yīng)60min,70℃反應(yīng)5min去除逆轉(zhuǎn)錄酶;取出反應(yīng)液,即為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系(10μL):2×SYBRGreenmixture5μL,上下游引物各1μL,cDNA1μL,RNaseFreewater2μL,反應(yīng)條件為:95℃,5min;進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)(95℃,10s;60℃,30s),40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線步驟,最終擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察有無非特異性擴(kuò)增及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。RealtimePCR使用引物序列見表1。1.3分組和給藥組間差異的比較應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)照組和各給藥組之間差異的比較用t檢驗(yàn),采用Pearson相關(guān)分析考察兩變量間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1p450的比較與健康對(duì)照組比較,模型組大鼠的P450水平顯著升高(P<0.01);灌胃后,DJC高劑量組與吡格列酮組P450水平均明顯下降(P<0.01);DJC低劑量組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與健康對(duì)照組比較,血糖、HbA2.2吡格列酮對(duì)tg水平的影響與健康對(duì)照組比較,模型組的TG顯著升高(P<0.01);予以DJC后,DJC高、低劑量組與吡格列酮組TG水平均明顯下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DJC高劑量組與吡格列酮組療效相近。各組間TC、LDL-G及HDL-C水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。P450與血脂相關(guān)分析顯示,P450與血脂各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表3。2.3溶解曲線和膨脹曲線3作用在本質(zhì)上發(fā)揮著重要作用。在現(xiàn)代社會(huì)中，各CYP450s又稱混合功能氧化酶,由一組結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的血紅素蛋白基因超家族編碼,在機(jī)體內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用。CYP450酶系的表達(dá)受基因型、性別、年齡、藥物和環(huán)境的影響,病理狀態(tài)下CYP450酶系