高活力酵母與高產(chǎn)乙醇酵母的同步篩選

高活力酵母與高產(chǎn)乙醇酵母的同步篩選

2.3.5-三氟甲基硫醇（ttc）是一種顯色劑，可以對各種細胞（細菌、植物等）產(chǎn)生色反應。TTC本身為無色,但能被活細胞中的呼吸鏈脫氫酶將無色的氧化態(tài)TTC還原為紅色的TTF(Triphenylformazan)現(xiàn)有的篩選高產(chǎn)乙醇酵母的方法還存在較多缺陷。第1是含有TTC培養(yǎng)基的平板制作復雜,接種酵母后生長比較緩慢,并且后續(xù)挑取顏色較深的酵母時,操作也比較繁瑣,需時較長;第2是利用人眼觀測通過TTC染色法的呈色反應后顏色的深淺來判斷細胞活力從而預測酵母產(chǎn)乙醇能力的高低,由于待篩選細胞繁多,很容易產(chǎn)生疲勞和誤差,影響細胞篩選的準確度和效率。本實驗探索利用TTC染色法和96孔板培養(yǎng)酵母細胞,通過酶標儀在一定波長下檢測,定量、快速、可靠地直接反應細胞活力,能夠顯著降低篩選時間及降低操作過程中的視覺判斷產(chǎn)生的人為誤差。1材料和方法1.1蘑菇酵母菌株#1-#23(共23株),J-10,J-19,J-27,OY-11(由本實驗室保藏)。1.2瓊脂粉、蛋白粉YPD斜面培養(yǎng)基:1L培養(yǎng)基含10g酵母粉,20g蛋白胨,20g葡萄糖,20g瓊脂粉。YPD液體培養(yǎng)基:1L培養(yǎng)基含10g酵母粉,20g蛋白胨,20g葡萄糖。1.3母乳細胞活性檢測方法的建立1.3.1萃取劑的選擇根據(jù)實驗設(shè)計,需選擇價格低廉、萃取效果好、毒性較低、并且對細胞培養(yǎng)板無腐蝕性的有機溶劑作為萃取劑。將培養(yǎng)好的酵母細胞菌液分別加入1mL乙酸乙酯、甲醇、丙酮、二甲基亞砜,振蕩后離心,取200μL上清液加入酶標板中,用酶標儀檢測其TTF吸收值。1.3.2核心糖酸亞還原酶tf值的檢測取1mL在含有TTC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)好的酵母細胞菌液10000r/min離心1min后棄上清液,加入1mL不同體積分數(shù)的二甲基亞砜溶液(100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%),充分混勻后10000r/min離心1min,取200μL上清液加入酶標板中,用酶標儀檢測其TTF吸收值。1.3.3ttf檢測取1mL培養(yǎng)好的酵母細胞液,10000r/min離心1min后棄上清液。加入1mL體積分數(shù)為85%的二甲基亞砜溶液,振蕩后離心機10000r/min離心1min,取200μL上清液加入酶標板中,用酶標儀進行全波長掃描,檢測TTF吸收值,檢測波長范圍為200~1000nm,步長為1nm。1.3.4ttd溶液的配制分別取1mL0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1g/L的TTC溶液加入10mL離心管中,加入2mLpH8.4Tris-HCl和1mL10g/L的Na1.3.5培養(yǎng)酵母種子液設(shè)置YPD培養(yǎng)基中TTC質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L。將培養(yǎng)好的酵母種子液按10%的接種量分別接入含有以上TTC濃度的YPD培養(yǎng)基中,200r/min30℃培養(yǎng)12h。分別取1mL培養(yǎng)好的菌液,10000r/min離心1min后棄上清液,再分別加入1mL二甲基亞砜溶液,充分混勻后10000r/min離心1min,取200μL上清液加入酶標板中,用酶標儀檢測其TTF吸收值。1.3.6ypd的培養(yǎng)設(shè)置YPD培養(yǎng)基中pH分別為1~14,將培養(yǎng)好的酵母種子液按10%的接種量分別接入以上pH的YPD培養(yǎng)基中,200r/min30℃培養(yǎng)12h。分別取1mL菌液10000r/min離心1min,棄上清液,再分別加入1mL二甲基亞砜溶液,充分混勻后10000r/min離心1min,取200μL上清液加入酶標板中,用酶標儀檢測其TTF吸收值。1.3.7菌株轉(zhuǎn)移及培養(yǎng)板制備取100μL待檢測酵母細胞菌液涂布于YPD固體平板培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h后挑取單菌落轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板。96孔細胞培養(yǎng)板中加入150μL的YPD培養(yǎng)液,并設(shè)置最終體積分數(shù)為0、10%、14%的乙醇,30℃200r/min培養(yǎng)4h后,測定其OD1.3.8ttf值的測定吸取100μL上述細胞培養(yǎng)板中振蕩離心后的上清液到96孔酶標板中,在486nm下測定TTF吸收值,根據(jù)TTF標準曲線及步驟1.3.2中測定的細胞OD1.3.9檢測液的配置使用氣相色譜內(nèi)標法測定各株菌株的乙醇產(chǎn)量。選用SGE30QC2/AC20-0.25毛細管柱,柱箱溫度60℃,進樣器溫度190℃,檢測器溫度240℃,內(nèi)標物為正丙醇,檢測液為6%正丙醇溶液與被測樣品混合液,檢測液配置方法:取0.5mL6%正丙醇溶液和0.5mL被測樣品加入10mL容量瓶,加水定容至10mL,測定時檢測液進樣量為2μL。通過氣相色譜內(nèi)標法測定各株菌的乙醇產(chǎn)量后,通過各株菌對應的胞內(nèi)TTF值,確定TTF值與乙醇產(chǎn)量的關(guān)系,最后篩選出具有較強活力的菌株。2結(jié)果與討論2.1試驗方法中試驗參數(shù)的確定2.1.1種有機溶劑對國內(nèi)樣品中ttf表達的影響表1為二甲基亞砜等所選4種有機溶劑的胞內(nèi)TTF提取效果比較。首先所選用的有機溶劑必須能夠最大程度地提取出胞內(nèi)所形成的TTF結(jié)晶。由表1可知,用二甲基亞砜提取TTF結(jié)晶時,其上清液中TTF吸收值達到1.127,分別為使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯時的1.19、1.55、1.80倍,在3種有機溶劑中效果最好。同時,考慮到有機溶劑對于96孔酶標板的腐蝕性,會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。相比于其他3種有機溶劑,二甲基亞砜對96孔酶標板無腐蝕性,在酶標儀檢測時,所測實驗數(shù)據(jù)真實可信。而且,二甲基亞砜價格較低,相比于其他幾種有機溶劑毒性較低。經(jīng)綜合考慮,本實驗選用二甲基亞砜作為TTF提取劑。2.1.2培養(yǎng)tf結(jié)晶二甲基亞砜最佳濃度的選擇結(jié)果見表2。由表2可知,體積分數(shù)為100%~85%的二甲基亞砜提取TTF結(jié)晶,上清液TTF吸收值都達到1.15左右,效果基本相當。當體積分數(shù)為80%時,吸收值為1.109,有一定程度的下降。當體積分數(shù)低于80%時,TTF吸收值有很明顯的下降,且隨二甲基亞砜濃度的降低而降低,故實驗中選用體積分數(shù)為85%的二甲基亞砜溶液。2.1.3ttf最大吸收波長的確定全波長掃描圖譜見圖1。由圖1可知,在486nm處TTF有一明顯的吸收峰,故本實驗選用486nm作為TTF吸收峰的檢測波長。2.1.4標準曲線的繪制按照1.3.1章節(jié)所述準備標準曲線制作的反應液,并以混合液于486nm處吸光值為縱坐標,TTC濃度為橫坐標繪制標準曲線,得到標準曲線方程為Y=-0.0009+14.72X,R2.1.5對酵母群體的活性由圖2可知,在TTC濃度為0.4%時所測的TTF的吸收值最高,超過這一濃度后TTF吸收值下降。這是由于TTC本身具有一定的毒性,過高的TTC濃度本身對細胞活性有一定的影響,溶液中積累TTC濃度越高,對細胞活性影響越大,細胞生長越慢,即細胞OD值越低。0.05%~0.2%時測得的TTF吸收值偏低,原因可能是由于溶液中TTC的含量太少,不足以測得培養(yǎng)液中所有酵母群體的活性。因此,本實驗選定反應體系中的TTC濃度為0.4%。2.1.6不同ph值對酵母細胞生長和od值的影響由圖3可知,反應液的pH<6時,測得的TTF吸收值很小,當反應液的pH在8~9時,所測得TTF吸收值較大,其中在pH為8時測得TTF吸收值最大。當pH>10時,所測得吸收值很小。其原因有:當pH值較低時,由于細胞處于較為不適的生長pH環(huán)境,所以生長較為緩慢,測得的細胞OD值也較低。當pH在中性微偏堿環(huán)境下時,酵母細胞處于較為適應的生長環(huán)境,其生長較快,且有最大活性,因此,測得細胞OD值也較高。當pH值超過10時,堿性環(huán)境不利于細胞生長,隨pH值降低,生長速度減慢,其細胞OD值也較低。故實驗中反應體系的pH值應控制在pH8左右。2.2酵母胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活力測定根據(jù)1.3建立的檢測方法以及乙醇產(chǎn)量檢測方法,從本實驗室保藏的27株菌株中篩選出具有較強活力的6株菌株,按細胞活力強弱依次排列為#5,#1,#8,OY-11,#7,#6,實驗結(jié)果見表3。從表3中可以看出:在乙醇體積分數(shù)為0%,10%,14%時,菌株#5TTF吸收值均為最高,分別達到0.819、0.795、0.365。菌株#5相比于其他5株菌,在有無乙醇壓力情況下都具有較為明顯的優(yōu)勢,可見其活性在測試的所有菌株中最強,其他菌株按活性強弱依次為#1,#8,OY-11,#7,#6。同時測定菌株乙醇產(chǎn)量,菌株#5的乙醇產(chǎn)量也為最高,達到5.87g/L,其他菌株按乙醇產(chǎn)量高低依次為#8,#1,OY-11,#7,#6。乙醇發(fā)酵過程中糖-乙醇轉(zhuǎn)化酶起主要作用,TTC能對酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生顯色反應,通過其顏色的深淺可以判斷其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活力的大小。顏色越深,表明TTC在酵母胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為TTF結(jié)晶含量越高,既TTF吸收值較高,同時也可表明其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性越強,細胞活性也越強,而轉(zhuǎn)化酶活力的強弱與乙醇產(chǎn)量有關(guān)。酶活越高,產(chǎn)乙醇能力也越強。菌株#5在乙醇壓力為0%,10%,14%時都具有最高的TTF吸收值,也就表明其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性在所有菌株中最強,乙醇產(chǎn)量也最高,通過表3中乙醇產(chǎn)量可以看出,#5菌株比其他菌株高出5%左右。通過分析其他菌株的TTF吸收值與乙醇產(chǎn)量可以看出,TTF值下降,細胞活性降低,乙醇產(chǎn)量也有一定程度下降。由此得出,菌株的細胞活力與乙醇產(chǎn)量在一定程度上是成正相關(guān)的。相比于原有研究中,王躍華等人報道TTC-脫氫酶還原法能夠檢測滇重樓地下莖的細胞活力,其目標為檢測細胞活性,而本研究所發(fā)明的TTC染色法用于酵母菌細胞活性的測定,使用96孔板及酶標儀快速檢測多株酵母,且最終目標定位于能夠通過比較TTF生成量與乙醇產(chǎn)量關(guān)系來篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌株,同時,本研究所建立的方法中,TTC工作濃度僅為0.4%,僅為前人報道的1/2,因此,本方法具有準確、高效、操作簡單、經(jīng)濟性等特點。3基于ttc染色法的高活力酵母細胞定量篩選方法的建立(1)本實驗選用體積分數(shù)為85%二甲基亞砜作為TTF最佳提取劑,培養(yǎng)液中TTC濃度為0.4%,溶液pH8,TTF最大吸收波長為486nm。通過檢測待測菌株在上述條件下培養(yǎng)后所測得的TTF吸收值,以及細胞OD值,可以