篩選標(biāo)記和目的基因

篩選標(biāo)記與目的基因楊旭160919012篩選標(biāo)記基因是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標(biāo)記的作用。在基因工程意義上來說，它是重組DNA載體的重要標(biāo)記，通常用來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化成功與否篩選標(biāo)記基因在遺傳轉(zhuǎn)化中擔(dān)負(fù)著區(qū)分轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體的重要作用。合適的篩選標(biāo)記基因及其相應(yīng)的篩選劑是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵。1.新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)(nptII)nptⅡ基因最初是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離得到的，即氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因，它編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此nptⅡ基因作為篩選標(biāo)記基因可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞對抗生素如卡那霉素、G418、巴龍霉素、新霉素等產(chǎn)生抗性，進(jìn)而達(dá)到篩選的效果。目前，該基因仍是植物基因工程中運(yùn)用很廣泛的選擇標(biāo)記基因。2.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)(hpt)從大腸桿菌中分離出來的hpt基因可以編碼HPT，使其具有潮霉素B的抗性。hpt基因被證明是單子葉植物較為理想的篩選基因，因其選擇效率高、基因型差異小、對轉(zhuǎn)化細(xì)胞不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生毒害作用、再生的轉(zhuǎn)基因植株育性較好等優(yōu)點(diǎn)在水稻、玉米和小麥等作物上得到了廣泛應(yīng)用。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻的有關(guān)研究中，均以HPT作為抗性選擇標(biāo)記。3.草丁膦N－乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)(bar)編碼PAT的bar基因最初是從吸水鏈霉菌中分離出來的。PAT能使草丁膦的自由氨基乙酰化，從而使草丁膦對植物無毒害作用。這種篩選體系具有快速簡便、高效，細(xì)胞產(chǎn)生的假轉(zhuǎn)化體少，并且使植物獲得優(yōu)良的抗除草劑農(nóng)藝性狀的優(yōu)點(diǎn)。它是目前用得最多的選擇標(biāo)記基因之一。4.

α-微管蛋白基因從牛筋草中分離得到的α－微管蛋白基因突變體對二硝基苯胺類除草劑(TFL)具有抗性。目前，已經(jīng)作為篩選標(biāo)記基因應(yīng)用于單子葉植物和雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化研究工作中。5.磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)(manA)編碼PMI的manA基因最初是從大腸桿菌中分離提取出來的，目前在酵母、動物及人體中都已分離得到編碼該蛋白的基因。然而，除肉桂和一些豆類外，自然界的植物中大都沒有編碼PMI的基因，因此以甘露糖為篩選劑的篩選體系在絕大多數(shù)植物的遺傳轉(zhuǎn)化中都可以應(yīng)用。并且被證明對環(huán)境和人體健康都十分安全。但是容易受到培養(yǎng)基或外植體內(nèi)其他糖類水平等生理因素的干擾，因此該篩選體系的完善還有待進(jìn)一步的研究。6.木糖異構(gòu)酶(xylA)xylA基因是由赤褐色鏈球菌和嗜熱厭氧桿菌中分離出來的。木糖是半纖維素的主要組成部分，是生物體內(nèi)含量僅次于葡萄糖的糖類。同甘露糖一樣，木糖也是許多植物細(xì)胞不能代謝利用的糖類，例如煙草、馬鈴薯和番茄不能用D-木糖作為唯一碳源。然而木糖異構(gòu)酶(D-syloseketol-isomerse)可以催化木糖成為D-木酮糖，D-木酮糖可作為碳源。這種篩選方法比nptII基因的篩選效率高10倍左右，并且發(fā)芽更快。研究證明這種酶是生物安全的并且在食品工業(yè)中得到普遍應(yīng)用。7.擬南芥ATP結(jié)合域(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC蛋白是植物中普遍存在的蛋白質(zhì)。在ABC蛋白質(zhì)家族中它們有30%～40%的結(jié)構(gòu)是相似的。擬南芥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是依據(jù)它們結(jié)構(gòu)域的同源性來分類的，但是它們的功能還不是很清楚。植物基因Atwbc19(2178bp)編碼一種特殊的擬南芥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這種蛋白可使轉(zhuǎn)基因植株具有卡那霉素的抗性。但是這種抗性機(jī)制與轉(zhuǎn)基因煙草用的CaMV35S啟動子啟動細(xì)菌抗藥基因的表達(dá)機(jī)制是不同的。由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物內(nèi)源蛋白，所以在同樣的抗性基因遺傳轉(zhuǎn)化工作中Atwbc19作為篩選標(biāo)記可以替代現(xiàn)在應(yīng)用廣泛的細(xì)菌標(biāo)記基因。因此這種標(biāo)記基因可能對于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因研究來說是具有應(yīng)用價(jià)值的。8.色氨酸合酶beta1(TSB1)色氨酸(Trp)是一種存在于植物中的必需氨基酸，它不能在動物中合成。通常狀態(tài)下植物并不合成Trp，只有處于傷害環(huán)境等脅迫條件下才誘導(dǎo)合成Trp。在植物中，AtTSB1基因的主要作用是將吲哚和絲氨酸轉(zhuǎn)變成為Trp。目前，Hsiao等研究發(fā)現(xiàn)AtTSB1基因在植物轉(zhuǎn)基因中可以作為一種新穎的非抗生素篩選標(biāo)記，對5-甲基色氨酸(5MT)或重金屬的選擇既簡便又快捷。在含有75μM5MT或者300μMCdCl2的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化植株效果很明顯。通過以上研究結(jié)果得出結(jié)論，AtTSB1轉(zhuǎn)基因植物中積累Trp可以限制Cd2+和其他重金屬的增加，或者抑制金屬轉(zhuǎn)運(yùn)物的活動。因此，重要的禾本科作物應(yīng)用AtTSB1基因作為篩選標(biāo)記基因遺傳轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植株能夠種植在重金屬污染的土壤中。9.氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因(aadA)雙子葉植物葉綠體轉(zhuǎn)化多采用aadA基因，用壯觀霉素(spectinomycin)進(jìn)行篩選，獲得同質(zhì)葉綠體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選周期不同受體材料差異很大，分化植株的前期篩選一般2～8個(gè)月，甜菜葉綠體轉(zhuǎn)化篩選8個(gè)月后才分化植株。棉花葉綠體轉(zhuǎn)基因從槍擊受體胚性愈傷到獲得同質(zhì)葉綠體轉(zhuǎn)基因植株則長達(dá)18個(gè)月。單子葉禾本科植物對壯觀霉素具有天然抗性，因此，水稻葉綠體轉(zhuǎn)化時(shí)aadA基因的篩選采用鏈霉素，鏈霉素的作用機(jī)理主要抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化綠苗和根的形成，愈傷組織階段篩選效果很不明顯，后期分化綠苗以及生根階段效果才體現(xiàn)出來，其作為禾本科作物的篩選標(biāo)記，效果并不理想。報(bào)告基因（reportergene）是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，其與目的基因融合后的表達(dá)產(chǎn)物可用來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。報(bào)告基因的基本單元包括啟動子和報(bào)告基因兩個(gè)部分。其中報(bào)告基因編碼易檢測蛋白或酶，而啟動子則調(diào)控序列表達(dá)。報(bào)告基因的選擇原則報(bào)告基因的產(chǎn)物和蛋白活性的定量檢測方法容易建立，并且快速簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好在被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中不存在報(bào)告基因產(chǎn)物或類似的內(nèi)源性物質(zhì)報(bào)告基因表達(dá)率與目的基因轉(zhuǎn)錄水平同步1報(bào)告基因的類型和特點(diǎn)1.1氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因最早應(yīng)用于檢測哺乳動物中的基因表達(dá).作為報(bào)告基因，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)產(chǎn)物比較穩(wěn)定，且在活性很低的水平就能被檢測出來.CAT能催化氯霉素乙?；磻?yīng)，將乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素的3-羥基位上，再通過測量放射性標(biāo)記的底物實(shí)現(xiàn)量化.CAT