蛋白質(zhì)分離純化檢測分析技術(shù)及其應(yīng)用

【范文澤】制作湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)信息專業(yè)1202班蛋白質(zhì)技術(shù)及其應(yīng)用分離純化，檢測分析ProteinSeparationandpurificationdetectionandanalysisThetechnologyandapplicationSeparationandpurification分離純化蛋白質(zhì)理化性質(zhì)detectionandanalysis檢測分析Separationandpurification分離純化沉淀透析層析電泳離心分離蛋白質(zhì)分子大小的差異蛋白質(zhì)的溶解度差異蛋白質(zhì)的電荷差異生物分子專一性結(jié)合的特性蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同沉淀鹽析

丙酮沉淀

免疫沉淀鹽析原理等電點(diǎn)沉淀pH控制saltprecipitation硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。

r不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，而蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，由此可把蛋白質(zhì)混合物分開。這樣沉淀出的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。

Principle

丙酮、甲醇、乙醇等沉淀:

此類有機(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低。低溫（零下40-60度）進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。免疫沉淀：由于蛋白質(zhì)具有抗原性，利用特異性的抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，從蛋白質(zhì)混合溶液中獲得相應(yīng)的抗原蛋白。透析原理Principle材料passiveTargeting利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而將其與小分子物質(zhì)分開玻璃紙或纖維素材料按照分子大小進(jìn)行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。只用來除鹽類和小分子雜質(zhì)電泳原理Principle分類ClassificationElectrophoresispH>pI蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極移動pH<pI蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極移動pH=pI蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。電泳即通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)得目的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理蛋白質(zhì)并非線形的，它存在二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子所帶的電荷不同SDS分子覆蓋所有蛋白質(zhì)顆粒表面消除蛋白質(zhì)分子形狀的影響掩蓋不同類蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別蛋白質(zhì)分子與帶負(fù)電荷較多的SDS分子結(jié)合蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率與分子量成線形關(guān)系層析原理Principle分類Classificationchromatography離子交換層析、凝膠層析和吸附層析等。待分離蛋白質(zhì)溶液在流動相的帶動下經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。凝膠層析離子交換層析凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡合物后，再以同一溶劑洗脫。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。

將作為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?。樣品中各種成分通過柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來，達(dá)到將各個成分分離的目的。離心原理Principle分類ClassificationCentrifuge將處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等稱為“顆?！?。每個顆粒都有一定大小、形狀、密度和質(zhì)量當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方向有關(guān)。

r差速離心法(differentialcentrifugation)

超速