微生物研究進展chapter5-分子生態(tài)學(xué)方法在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用課件

第五章分子生態(tài)學(xué)方法在環(huán)境研究領(lǐng)域的應(yīng)用農(nóng)學(xué)系生物技術(shù)專業(yè)課程《微生物學(xué)研究進展》第五章分子生態(tài)學(xué)方法在環(huán)境農(nóng)學(xué)系生物技術(shù)專業(yè)課程《微生物學(xué)1一、微生物分子生態(tài)學(xué)的理論二、微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法三、展望一、微生物分子生態(tài)學(xué)的理論2墨西哥灣“深海地平線”鉆油臺2010年4月20日爆炸起火沉沒后不斷漏油。鉆油臺所屬的英國石油公司近日宣布又發(fā)現(xiàn)一處泄漏點，令漏油量多達每日5000桶，是原先估計的5倍，并正逼近美南部4個州的海岸。

墨西哥灣“深海地平線”鉆油臺2010年4月20日爆炸起火沉沒3微生物研究進展chapter5-分子生態(tài)學(xué)方法在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用課件41、傳統(tǒng)培養(yǎng)法的瓶頸

微生物多樣性被用于監(jiān)視和預(yù)測環(huán)境變化,也是新基因資源的重要來源。傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)雖然已經(jīng)幫助人們認識了很多微生物，創(chuàng)造了巨大的財富，但是由于

什么原因？各種環(huán)境中能純培養(yǎng)的微生物種類非常有限，遠遠不能反映出自然界微生物多樣性的豐度和范圍。

一、微生物分子生態(tài)學(xué)的理論1、傳統(tǒng)培養(yǎng)法的瓶頸微生物多樣性被用于監(jiān)視和預(yù)測52、微生物分子生態(tài)學(xué)的產(chǎn)生

為了突破傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法的限制，必須要有一種能繞過純培養(yǎng)這一步的新技術(shù)，來推動微生物多樣性的研究。2、微生物分子生態(tài)學(xué)的產(chǎn)生為了突破傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法的限制，必6微生物分子生態(tài)學(xué)的產(chǎn)生使得微生物群落的研究由細胞水平深入到分子機制研究水平,提出了微生物分子進化和分子適應(yīng)等全新概念,使微生物生態(tài)學(xué)理論更加接近自然本質(zhì)。微生物分子生態(tài)學(xué)的產(chǎn)生使得微生物群落的研究由細胞水平深入到分73、微生物分子生態(tài)學(xué)的概念利用分子生物學(xué)技術(shù)手段研究自然界微生物與生物及非生物環(huán)境之間相互關(guān)系及其相互作用規(guī)律的科學(xué)。主要研究微生物區(qū)系組成、結(jié)構(gòu)、功能、適應(yīng)性發(fā)展及其分子機制等微生物生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)理論問題。

3、微生物分子生態(tài)學(xué)的概念利用分子生物學(xué)技術(shù)8墨西哥灣“深海地平線”鉆油臺2010年4月20日爆炸起火沉沒后不斷漏油。鉆油臺所屬的英國石油公司近日宣布又發(fā)現(xiàn)一處泄漏點，令漏油量多達每日5000桶，是原先估計的5倍，并正逼近美南部4個州的海岸。

墨西哥灣“深海地平線”鉆油臺2010年4月20日爆炸起火沉沒9環(huán)境微生物群落微生物代謝生理學(xué)方法生物化學(xué)方法分子生物學(xué)方法呼吸醌指紋法

脂肪酸指紋法PLFABIOLOG法雜交法基于16SrDNA方法宏基因組核酸探針雜交熒光原位雜交FISH16SrDNA克隆文庫DGGE/TGGESSCPT-RFLP、ARDRARFLP、RISARADP、ERIC等基因芯片技術(shù)二、微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法環(huán)境微生物群落微生物代謝生理學(xué)方法生物化學(xué)方法分子生物學(xué)方法101、研究路線1、研究路線11分析方法方法類別原理優(yōu)點缺點分子雜交核酸探針雜交DNA的變性、復(fù)性及其在復(fù)性過程中的堿基配對原則、探針與靶分子的特異性結(jié)合過程簡單避免PCR偏差影響雜交分析結(jié)果的因素復(fù)雜，只能用來檢測事先已知其目標基因序列的微生物FISH人工合成的熒光或放射性標記探針與微生物基因組雜交操作簡單，可原位檢測，檢測靈敏度高只能對特定類群的微生物進行研究其它分子生物學(xué)方法RFLP序列差異引起限制性內(nèi)切酶酶切位點的差異信息量大重復(fù)性高周期長，過程繁瑣RAPD利用隨意設(shè)計的非特異引物簡單、迅速重復(fù)性低ERIC腸桿菌基因間重復(fù)共有序列在不同種屬或者同屬的不同種微生物之間的拷貝數(shù)和定位的差異引起兩個ERIC之間序列的多態(tài)性結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好靈敏度高PCR反應(yīng)本身的擴增和偏差可能會產(chǎn)生假陽性，不能對群落中感興趣的菌進一步研究分析方法原理優(yōu)點缺點分子核酸DNA的變性、復(fù)性及其過程簡單影12分析方法方法類別原理優(yōu)點缺點基于16SrDNA的方法16SrDNA克隆文庫可以用來揭示不同物種的系統(tǒng)進化關(guān)系反映各種微生物種類構(gòu)成和親緣關(guān)系工作量大，成本高，不能對目標種群進行原位和實時的檢測DGGE不同的變性劑濃度，解鏈之后電泳速度將會急劇下降DNA片段純化后可以直接用于測序分辨率低，被分析的片段不能大于400bpTGGE溫度梯度，利用不同序列結(jié)構(gòu)的DNA，雙鏈具有不同的熔點溫度Tm同上同上SSCP長度相同但序列不同的單鏈DNA具有空間構(gòu)象上的差異操作比較簡便價格低廉靈敏度和重現(xiàn)度差，150～400bp最佳的分離效果ARDRA16SrDNA序列的差異，限制性核酸內(nèi)切酶酶切后將得到長度與數(shù)量不同的DNA片段分辨率高對圖譜進行定量化解析和進行群落間的比較都十分困難T-RFLPPCR擴增中所用引物的一端或兩端帶有熒光標記方便快捷分辨率高靈敏度高復(fù)雜群落多樣性的低估、影響因素多、無法對微生物定性分析RISA核糖體區(qū)間序列多態(tài)性操作簡單、序列多態(tài)性豐富核糖體的拷貝數(shù)的不同會產(chǎn)生假陽性分析方法原理優(yōu)點缺點基于16S可以用來揭示反映各種微工作量大132、熒光原位雜交（FISH）利用生物素或地高辛等非放射性物質(zhì)標記探針，并通過熒光直接標記或者熒光素偶聯(lián)的抗原-抗體檢測系統(tǒng)，對DNA或RNA進行定性或定位分析。2、熒光原位雜交（FISH）利用生物素或地高辛等非放射性142、基于16SrDNA的指紋圖譜法為什么選擇16SrRNA基因作為微生物進化的遺傳標記?2、基于16SrDNA的指紋圖譜法為什么選擇16SrRN15方法：16SrDNA克隆文庫/ARDRADGGE/TGGERFLP/T-RFLPRISA（ITS）SSCP方法：16SrDNA克隆文庫/ARDRA16⑴構(gòu)建16SrDNA克隆文庫環(huán)境樣品提基因組擴增混合基因組16SrDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞微生物群落結(jié)構(gòu)信息挑取單克隆鑒定是否為陽性克隆酶切、PCR方法鑒定全部陽性克隆測序與數(shù)據(jù)庫序列比對系統(tǒng)發(fā)育分析陽性克隆鑒定PCR擴增所有16SrDNA片段兩種或兩種以上四堿基限制性內(nèi)切酶酶切內(nèi)切酶圖譜分型每種類型挑選1-3個克隆測序序列比對及分析由于載體與DNA片段一一對應(yīng)，可得到單個DNA片段重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化時過程中絕大多數(shù)感受態(tài)細胞只能接受一個外源DNA分子，由此便可達到把混合片段分開的目的ARDRA⑴構(gòu)建16SrDNA克隆文庫環(huán)境樣品提基因組擴增混合基17優(yōu)點得到的序列信息比較完整片段攜帶的信息量大，結(jié)果可靠適合對環(huán)境中微生物群落的整體結(jié)構(gòu)進行分析

缺點工作量大不能對目標種群進行原位和實時監(jiān)測優(yōu)點18VinhD.Pham等人用16SrDNA文庫結(jié)合fosmid方法研究了阿拉斯加某中溫油藏采出水中細菌和古細菌的多樣性，結(jié)果表明古細菌和細菌數(shù)量均等，未培養(yǎng)微生物約占檢出總量的30%左右，檢測到的古細菌主要是乙酸型產(chǎn)甲烷古菌。佘躍惠等人也用16SrDNA文庫結(jié)合TGGE方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多樣性，結(jié)果表明注水井中的微生物多樣性比采油井中豐富，注水井樣品中的細菌主要屬于變形菌門和放線菌綱,尤其是紅細菌亞綱(47%)。采油井樣品的細菌主要屬于變形菌門,尤其是假單胞菌屬(62%)。通常采用構(gòu)建16SrDNA文庫方法與其它分子生物學(xué)方法聯(lián)合，對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析。VinhD.Pham等人用16SrDNA文庫結(jié)合fos1916SrDNA克隆文庫數(shù)據(jù)分析根據(jù)不同的酶切圖譜分型后，可以得到該環(huán)境樣品中的微生物組成信息。同時，根據(jù)每一個OTU所含的克隆數(shù)目，也可以推測出該環(huán)境中的優(yōu)勢菌群。OTUsMatch_NameclonenumbertheratioofallclonesgenusOTU1MethanosaetathermophilaPT3427.42%甲烷鬃菌屬OTU2Methanolineatarda43.23%甲烷繩菌屬OTU3Unculturedarchaeon10.81%

未培養(yǎng)古菌OTU4Unculturedarchaeon10.81%

未培養(yǎng)古菌OTU5Unculturedarchaeon54.03%

未培養(yǎng)古菌OTU6Unculturedarchaeon75.65%未培養(yǎng)古菌

OTU7Unculturedarchaeon118.87%未培養(yǎng)古菌

OTU8Unculturedarchaeon10.81%未培養(yǎng)古菌

OTU9Unculturedeuryarchaeote10.81%未培養(yǎng)牛瘤胃古菌

OTU10UnculturedMethanosarcinales5241.94%甲烷八疊球菌屬OTU11Unculturedeuryarchaeoteclone10.81%未培養(yǎng)牛瘤胃古菌OTU12Unculturedcrenarchaeote21.61%

泉古菌門OTU13UnculturedMethanosaetasp.10.81%甲烷鬃菌屬OTU14Unculturedarchaeon21.61%

未培養(yǎng)古菌OTU15Unculturedarchaeon10.81%未培養(yǎng)古菌

以大慶油田采出水樣品古菌文庫為例：16SrDNA克隆文庫數(shù)據(jù)分析根據(jù)不同的酶切圖譜20⑵變性梯度凝膠電泳DGGE產(chǎn)生：1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于檢測DNA片段中的點突變的一種電泳技術(shù)原理：

堿基組成不同DNA序列，其解鏈溫度也各不相同。由此，便可通過設(shè)定不同的變性條件（變性劑濃度或者溫度）將不同的DNA片段分開。

特點：分離大小相同，但堿基組成不同的序列⑵變性梯度凝膠電泳DGGE產(chǎn)生：2116SrDNA的高可變區(qū)E.coli16SrRNA二級結(jié)構(gòu)及各可變區(qū)

V3區(qū)約170bpV6-V8區(qū)約350bp片段大小不同，攜帶的信息量不同，選擇不同的區(qū)域得到DGGE圖譜不同，群落信息也有差異不同的片段大小對應(yīng)的膠濃度也不同根據(jù)需要選擇最合適的提取基因組后，擴增16SrDNA高可變區(qū)片段16SrDNA的高可變區(qū)E.coli16SrRNA二22確定合適的變性劑范圍對DNA片段進行有效分離根據(jù)變性劑梯度方向與電泳方向相同或不同,DGGE分為：垂直DGGE平行DGGE確定合適的變性劑范圍對DNA片段進行有效分離根據(jù)變性劑梯度方23GC-Clamp調(diào)節(jié)目的序列的解鏈行為，為一段40bp的高GC含量的片段常規(guī)的DGGE電泳技術(shù)對于長度超過500bp的DNA片段的序列變化情況,只能有50%的檢出率。

應(yīng)用“GC夾板”技術(shù)可使檢出率提高到100%。當?shù)乳L的雙鏈DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時,因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關(guān);部分解鏈的DNA分子的遷移速度隨解鏈程度增大而減小。GC-Clamp16SrDNA低濃度高濃度GC-Clamp當?shù)乳L的雙鏈DNA分子在含梯度變性劑24DGGE的參數(shù)：膠濃度取決于片段大小，通常不宜超過500bp6%膠濃度：400～1000bp8%膠濃度：200～400bp10%膠濃度：100～300bp

變性劑范圍不同的樣品不同溫度一般都用60攝氏度電壓時間DGGE的參數(shù)：膠濃度取決于片段大小，通常不宜超過25環(huán)境樣品分析的流程環(huán)境樣品分析的流程26DGGE在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用對微生物群落結(jié)構(gòu)進行對比、分析或者跟蹤監(jiān)測。通過擴增功能基因來研究功能基因及功能菌群的多樣性。

跟蹤及檢測細菌的富集和分離，評價不同的培養(yǎng)條件對分離菌種的影響。DGGE在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用對微生物群落結(jié)構(gòu)進行對比27舉例：油藏古細菌V3區(qū)DGGE圖譜膠濃度：10%變性劑范圍：40%-60%電壓：200V運行時間：4.5h舉例：油藏古細菌V3區(qū)DGGE圖譜28優(yōu)點：缺點：分辨率有限，復(fù)雜環(huán)境中（土壤或腸道），只能檢測出優(yōu)勢菌。一般只能分析500bp以下的片段。PCR過程產(chǎn)生的異源雙鏈和單鏈DNA會對分析造成偏差。優(yōu)點：29RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）探針：限制性內(nèi)切酶：HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、XbaⅠ等。RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）探針：30優(yōu)點遍布整個基因組，數(shù)據(jù)多態(tài)信息量大結(jié)果非常穩(wěn)定，重復(fù)性好，探針多缺點技術(shù)復(fù)雜，周期長，費用高檢測中需放射性物質(zhì)，限制了廣泛應(yīng)用DNA量大，分析速度慢

優(yōu)點31T-RFLP（末端限制性片段長度多態(tài)性）每個熒光峰至少代表一個細菌或幾個近緣的細菌每個峰面積占總峰面積的百分數(shù)代表這個末端限制性片段的相對數(shù)量，可粗略認為與細菌在某一部位的微生態(tài)群落中的相對數(shù)量T-RFLP（末端限制性片段長度多態(tài)性）每個熒光峰至少代表32T-RFLP的優(yōu)點：相對于其它方法，T-RFLP技術(shù)分析更為迅速，且結(jié)果可以數(shù)據(jù)的形式輸出，因而在微生物群落的快速檢測和分析中更有優(yōu)勢。T-RFLP的優(yōu)點：33分析方法方法類別原理優(yōu)點缺點基于16SrDNA的方法16SrDNA克隆文庫可以用來揭示不同物種的系統(tǒng)進化關(guān)系反映各種微生物種類構(gòu)成和親緣關(guān)系工作量大，成本高，不能對目標種群進行原位和實時的檢測DGGE不同的變性劑濃度，解鏈之后電泳速度將會急劇下降DNA片段純化后可以直接用于測序分辨率低，被分析的片段不能大于400bpTGGE溫度梯度，利用不同序列結(jié)構(gòu)的DNA，雙鏈具有不同的熔點溫度Tm同上同上SSCP長度相同但序列不同的單鏈DNA具有空間構(gòu)象上的差異操作比較簡便價格低廉靈敏度和重現(xiàn)度差，150～400bp最佳的分離效果ARDRA16SrDNA序列的差異，限制性核酸內(nèi)切酶酶切后將得到長度與數(shù)量不同的DNA片段分辨率高對圖譜進行定量化解析和進行群落間的比較都十分困難T-RFLPPCR擴增中所用引物的一端或兩端帶有熒光標記方便快捷分辨率高靈敏度高復(fù)雜群落多樣性的低估、影響因素多、無法對微生物定性分析RISA核糖體區(qū)間序列多態(tài)性操作簡單、序列多態(tài)性豐富核糖體的拷貝數(shù)的不同會產(chǎn)生假陽性分析方法原理優(yōu)點缺點基于16S可以用來揭示反映各種微工作量大34分析方法方法類別原理優(yōu)點缺點分子雜交核酸探針雜交DNA的變性、復(fù)性及其在復(fù)性過程中的堿基配對原則、探針與靶分子的特異性結(jié)合過程簡單避免PCR偏差影響雜交分析結(jié)果的因素復(fù)雜，只能用來檢測事先已知其目標基因序列的微生物FISH人工合成的熒光或放射性標記探針與微生物基因組雜交操作簡單，可原位檢測，檢測靈敏度高只能對特定類群的微生物進行研究其它分子生物學(xué)方法RFLP序列差異引起限制性內(nèi)切酶酶切位點的差異信息量大重復(fù)性高周期長，過程繁瑣RAPD利用隨意設(shè)計的非特異引物簡單、迅速重復(fù)性低ERIC腸桿菌基因間重復(fù)共有序列在不同種屬或者同屬的不同種微生物之間的拷貝數(shù)和定位的差異引起兩個ERIC之間序列的多態(tài)性結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好靈敏度高PCR反應(yīng)本身的擴增和偏差可能會產(chǎn)生假陽性，不能對群落中感興趣的菌進一步研究分析方法原理優(yōu)點缺點分子核酸DNA的變性、復(fù)性及其過程簡單影35三、展望使用微生物分子生態(tài)學(xué)方法，繞過了純培養(yǎng)的瓶頸，可以普遍的、定量的、系統(tǒng)的描述微生物的多樣性，從而能夠以相對無偏見的方式了解環(huán)境中的微生物及其生態(tài)系統(tǒng)。三、展望使用微生物分子生態(tài)學(xué)方法，繞過了純培養(yǎng)的瓶頸，可以36存在的問題：環(huán)境樣品在提取核酸前,無論是厭氧或是室溫存放，樣品中的微生物仍不可避免的發(fā)生一些變化。每次提取DNA的效率不同,影響結(jié)果的重復(fù)性;提取核酸時,細胞的裂解程度不均一;引物對樣品中不同微生物核酸擴增效率不同;在真核微生物生態(tài)學(xué)的分析上還是比較少。存在的問題：環(huán)境樣品在提取核酸前,無論是厭氧或是室溫存放，37現(xiàn)在，微生物分子生態(tài)學(xué)研究已經(jīng)超越了單純說明環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的階段；重心轉(zhuǎn)移到了群落功能方面的研究，一方面要求深入挖掘已有方法的潛力，另一方面也嘗試著多種方法的聯(lián)合，最終分析清楚各種微生物在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的作用，將微生物群落結(jié)構(gòu)和群落功能聯(lián)系起來。這也是微生物分子生態(tài)學(xué)研究的最終目的。現(xiàn)在，微生物分子生