第三章 液相色譜法

第三章液相色譜法第1頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2第2頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3液相色譜儀（2）第3頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4液相色譜儀（3）第4頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5北京瑞利第5頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6

§3-1概述高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率

和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化

操作。

高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來(lái)的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù).第6頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7高效液相色譜經(jīng)典色譜第7頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月8經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長(zhǎng)。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.5

107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。第8頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成。

液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。

§3-1概述一、液相色譜分離原理及分類第9頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月10液相色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過(guò)程的保留行為。

§3-1概述

根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。第10頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月11二、液相色譜與氣相色譜的比較

液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動(dòng)相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同；此外，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：第11頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對(duì)高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70~80%。

二、液相色譜與氣相色譜的比較（1）應(yīng)用范圍不同第12頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月13

因?yàn)椋孩贇庀嗌V的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。

二、液相色譜與氣相色譜的比較（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作第13頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月14②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。

③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。二、液相色譜與氣相色譜的比較第14頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月15（3）由于液體的擴(kuò)散系數(shù)比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。二、液相色譜與氣相色譜的比較第15頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月16

綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學(xué)、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

§3-1概述第16頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月17§3–2高效液相色譜儀第17頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月18§3–2高效液相色譜儀高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過(guò)程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入待分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。第18頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月19貯液器高壓泵檢測(cè)器梯度淋洗裝置色譜柱壓力表進(jìn)樣器餾分收集器高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)第19頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)第20頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月21第21頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月22

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是儀器最重要的部件：由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵**、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成。

對(duì)高壓輸液泵的要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。1.高壓輸液系統(tǒng)§3–2高效液相色譜儀第22頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月23常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種?！?–2高效液相色譜儀恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重現(xiàn)性差它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍恒流泵分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵**兩種第23頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月24高壓輸液泵：主要部件之一，壓力：150～450×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。第24頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月252．進(jìn)樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5-30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

第25頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月26

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第26頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月27準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)流動(dòng)相入口色譜柱入口樣品出口樣品入口流動(dòng)相入口色譜柱入口樣品環(huán)第27頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月283分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技術(shù)的性能不受影響。第28頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月29柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。

對(duì)色譜柱的要求：柱效高，選擇性好，分析速度快等。

第29頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月30第30頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月31使用色譜柱注意事項(xiàng)：1溶劑要脫氣，溶劑和樣品應(yīng)過(guò)濾，防止堵塞。2加前置柱。3更換流動(dòng)相要漸變。4用后要保護(hù)好。第31頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月324．檢測(cè)系統(tǒng)

HPLC與GC一樣，要求檢測(cè)器靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，對(duì)溫度和流速的變化不敏感，應(yīng)用范圍廣，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)器分為兩大類：一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:第32頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月33HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器。它的原理基于待測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外或可見(jiàn)光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律。高效液相色譜檢測(cè)器：（1）紫外光度檢測(cè)器（UV）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好，對(duì)流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測(cè)量10-9g·mL-1。第33頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月34高效液相色譜檢測(cè)器：（1）紫外光度檢測(cè)器（UV）缺點(diǎn)：只適用于檢測(cè)能吸收紫外、可見(jiàn)光的物質(zhì)，流動(dòng)相選擇受限制。要求流動(dòng)相在測(cè)定波長(zhǎng)下無(wú)吸收。第34頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月35光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第35頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月36

檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。它的作用原理是純流動(dòng)相與包含樣品的流動(dòng)相之間的折射率不同，檢測(cè)器把這種差值檢測(cè)出來(lái)，給出信號(hào)，信號(hào)的大小與樣品含量成正比。純流動(dòng)相與待測(cè)組分的折射率相差越大，檢測(cè)器靈敏度越高，靈敏度可達(dá)10-7g·cm-3。通用性強(qiáng)，不破壞樣品，線性范圍寬。主要缺點(diǎn)是靈敏度低，不適宜痕量分析。對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）熒光檢測(cè)器（4）電導(dǎo)檢測(cè)器

（2）示差折光率檢測(cè)器第36頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月37它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置.HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫一樣。

對(duì)于某些復(fù)雜樣品，組分的k′范圍很寬，用一種強(qiáng)度的溶劑淋洗時(shí)不能得到很好的分離，采用梯度淋洗。就是組成流動(dòng)相的兩種或兩種以上不同的溶劑按一定程序改變配比、極性、pH、離子強(qiáng)度、通過(guò)流動(dòng)相極性的變化來(lái)改變待分離樣品的選擇因子和tR，提高分離效果和分析速度。5、附屬系統(tǒng)第37頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月38梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第38頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月上節(jié)課內(nèi)容回顧液相色譜特點(diǎn)液相色譜儀的組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)第39頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月403-3高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。

固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。第40頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月411.表面多孔型固定相

它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。

第41頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月422．全多孔型固定相它由直徑為10μm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.第42頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月43（二）流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。表中列出了一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)。第43頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月44

對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。第44頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月45（3）高純度。由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～100

nm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。(5)低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離.第45頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月46流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第46頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月47流動(dòng)相組成

流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第47頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月481.吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過(guò)在載體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在載體表面。3-4高效液相色譜法的主要類型及選擇HPLC根據(jù)分離機(jī)理的不同分為幾種類型：第48頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月49高效液相色譜法的主要分離類型3.離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；第49頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月503-4高效液相色譜法的主要類型及選擇一、液一液分配色譜法（LLPC）

在液-液色譜中，流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1．分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。第50頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月51

2、固定相

由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。詳細(xì)介紹見(jiàn)后。

第51頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月523．流動(dòng)相

在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。

如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。

如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。

第52頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月53二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。

由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。第53頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月541．鍵合固定相類型用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團(tuán)如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季胺鹽；作為陽(yáng)離子交換基團(tuán)的磺酸基等.第54頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月552．反相健合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇—水、乙腈一水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。

它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。

第55頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月563.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。

這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。第56頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月574.離子性鍵合相色譜法

當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、－C00H等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。

以上討論了各種類型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)是：通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有80％的分離問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點(diǎn)是不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系。第57頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月58

第58頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月59三、液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。1．分離原理當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，與流動(dòng)相溶劑分子（S）在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:X+nS吸附=X吸附+nS第59頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月60

X+nS吸附=X吸附+nS達(dá)平衡時(shí)，有其中K為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。K值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。第60頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月612．固定相吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。第61頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月623、流動(dòng)相一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。第62頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月63四、離子交換色譜法（IEC）此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。第63頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月641．離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽(yáng)離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A第64頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月65

2．固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）第65頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月66第66頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月673．流動(dòng)相離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）水的緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。

第67頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月68五、凝膠色譜法（SEC）

凝膠色譜法又稱尺寸排阻色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。

尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。第68頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月69

1．分離原理

凝膠色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過(guò)程模型見(jiàn)圖：第69頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月70第70頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聚合物溶液進(jìn)入色譜柱后，由于濃度差，所有溶質(zhì)分子都力圖向凝膠表面孔穴滲透。體積較小的分子——既能進(jìn)入較大的孔穴，也可以進(jìn)入較小的孔穴，向孔內(nèi)擴(kuò)散的較深；體積較大的分子——只能進(jìn)入較大的孔穴；體積更大的分子——不能進(jìn)入孔穴，只能從凝膠的空隙流過(guò)。第71頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聚合物試樣進(jìn)入色譜柱后處于溶劑的淋洗之下：1)高分子量級(jí)分在柱內(nèi)停留時(shí)間很短，很快就被溶劑淋洗出來(lái)；2)分子量中等級(jí)分在柱內(nèi)的停留時(shí)間較長(zhǎng)，它們隨淋洗液緩慢的帶出；3)分子量最小的級(jí)分在柱內(nèi)的停留時(shí)間最長(zhǎng)，最后被溶劑淋洗出；按照淋出的先后順序，依次收集到分子量從大到小的各個(gè)級(jí)分，從而達(dá)到對(duì)聚合物分級(jí)的目的。第72頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月732．固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。

所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。第73頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月743．流動(dòng)相

排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小。選擇溶劑還必須與檢測(cè)器相匹配。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第74頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、GPC結(jié)構(gòu)和儀器工作示意圖試樣和溶劑注入系統(tǒng)，主要包括：溶劑儲(chǔ)槽、脫氣室、過(guò)濾器、精密計(jì)量泵、進(jìn)樣裝置；色譜柱系統(tǒng)，包括柱溫控制箱；檢測(cè)系統(tǒng)——各種檢測(cè)器（RI、UV等）；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（包括模數(shù)轉(zhuǎn)換器、計(jì)算機(jī)、打印機(jī)/繪圖儀等）；控制系統(tǒng)。第75頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第76頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溶劑的選擇在凝膠色譜分離中,溶劑是流動(dòng)相，它的作用沒(méi)有其他液相色譜重要。樣品中不同分子量級(jí)分的分離并不依賴于溶劑與樣品之間的相互作用力。因此溶劑的選擇主要是從對(duì)樣品的溶解能力,溶劑與儀器的匹配以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理的方便來(lái)考慮。第77頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜柱系統(tǒng)包括參與柱、分離柱和柱溫控制箱。色譜柱是一支內(nèi)部裝有凝膠填料的不銹鋼管。柱內(nèi)凝膠材料的選擇很重要，要有較高的分離效果、良好的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，同時(shí)還要求有較好的機(jī)械強(qiáng)度和低流動(dòng)阻力。交聯(lián)PS凝膠——適用于非極性有機(jī)溶劑。多孔硅膠——化學(xué)惰性、熱穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度好、可以在柱中直接更換溶劑。多孔玻璃——水溶液體系第78頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月凝膠色譜柱的選擇1）根據(jù)滲透極限和分離范圍進(jìn)行選擇；通?？刹捎么钆渲拥姆椒?將不同規(guī)格的凝膠柱串聯(lián)起來(lái),可以起到更好的分離效果；2）根據(jù)溶劑體系——水溶性/油溶性；3）考慮凝膠的熱穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)惰性差。第79頁(yè)，課件共87頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器的作用是將色譜柱淋出液中樣品的組成、含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，從而完成定性、定量的判斷分離情況的任務(wù)。用于GPC的檢測(cè)器很多，包括：示差折光檢測(cè)器——適用于所有聚合物的檢測(cè)；紫外/紅外檢測(cè)器——適用于對(duì)該檢測(cè)器有特殊響應(yīng)的聚合物。自動(dòng)餾分收集器——自動(dòng)計(jì)算出淋出液的體積；由此得到隨