下瘀血湯、茵陳蒿湯、一貫煎、黃芪湯對ccl4大鼠肝硬化成型階段的干預(yù)作用

下瘀血湯、茵陳蒿湯、一貫煎、黃芪湯對ccl4大鼠肝硬化成型階段的干預(yù)作用

近年來，中醫(yī)在肝屏障和肝硬化方面發(fā)揮著明顯的優(yōu)勢。它不僅能改善臨床癥狀和肝功能，提高患者的生活質(zhì)量，還能抑制肝炎反應(yīng)及纖維組織增生，促進肝臟鈣化的逆轉(zhuǎn)。體內(nèi)、外實驗研究表明,中藥復(fù)方具有多途徑的綜合作用。但已往的研究只注重“病”而忽視了“證候病機”,對于針對肝硬化中醫(yī)證候病機的基本治法、方劑尚無系統(tǒng)的比較研究,中醫(yī)學(xué)的精髓——“辨證論治”的科學(xué)內(nèi)涵有待深入探索。目前,中醫(yī)對肝硬化病機的認識已逐漸趨向一致,綜合名老中醫(yī)的觀點及有關(guān)臨床報道,肝硬化的中醫(yī)基本病機為氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)、濕熱內(nèi)蘊等,益氣、養(yǎng)陰、化瘀及清熱利濕是常用的基本治法?；谝陨险J識,本研究以進展期四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)大鼠肝硬化模型為載體,緊密結(jié)合臨床實際,以肝纖維化已經(jīng)形成并向肝硬化發(fā)展的時期作為干預(yù)治療的切入點,探討臨床治療肝硬化常用的代表不同治法的經(jīng)典復(fù)方(清熱利濕的茵陳蒿湯、益氣的黃芪湯、活血化瘀的下瘀血湯、養(yǎng)陰疏肝的一貫煎)對肝硬化成型階段的干預(yù)作用及其取效的證候病機基礎(chǔ)。材料和方法1實驗動物中心Wistar雄性大鼠94只,清潔級,體重130~150g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心,許可證號:SCXK(滬)2003-0003。上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)、造模和觀察,自由飲食。2小柴胡湯的制備下瘀血湯、茵陳蒿湯、黃芪湯、一貫煎所含的生藥均購自上海華宇藥業(yè)有限公司,有明確的原產(chǎn)地,經(jīng)生藥學(xué)專家鑒定,按照原方比例和制法由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心一次制備干燥后冷藏,小柴胡湯購自日本ツムラ株式會社(TJ-9顆粒劑,成人每日用量7.5g),為對照藥物。CCl4分析純和橄欖油購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;肝功能測定試劑盒分別購自衛(wèi)生部上海生物制品研究所及南京建成生物工程研究所;羥脯氨酸標準品購自日本ナカティテスク株式會社,批號:MIR8282。3模型準備首次以CCl43ml/kg劑量皮下注射,以后以50%的CCl4橄欖油溶液2ml/kg劑量皮下注射,每周2次,共12周。4用藥干預(yù)方法造模4、8周后,隨機抽取正常及模型大鼠各6只,處死作動態(tài)觀察。其余模型大鼠隨機分為模型對照組(10只)、下瘀血湯組(9只)、茵陳蒿湯組(10只)、黃芪湯組(10只)、一貫煎組(9只)、小柴胡湯組(9只)干預(yù)治療。第9周開始,于繼續(xù)造模的同時,藥物干預(yù)組按成人(65kg)每kg體重日用量的8倍,即下瘀血湯0.36g/kg(相當于生藥3.2g/kg);茵陳蒿湯0.695g/kg(相當于生藥4.185g/kg);黃芪湯0.935g/kg(相當于生藥4.923g/kg);一貫煎2.628g/kg(相當于生藥7.938g/kg);小柴胡湯顆粒劑0.923g/kg,分別用蒸餾水10ml稀釋灌胃,每日1次,共計4周。正常組(8只)與模型對照組以同體積生理鹽水灌胃。5肝組織病理學(xué)檢測造模12周結(jié)束,大鼠用2%戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔注射麻醉后,仰臥位固定,打開腹腔,觀察肝脾的色、質(zhì)、形態(tài)、體積等情況。經(jīng)下腔靜脈采血,摘取肝脾,稱重,從肝右葉切取1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝組織1塊,10%中性福爾馬林固定,脫水、包埋,切片,HE及膠原染色,觀察組織學(xué)變化;留取肝組織作羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量測定。所采血液4℃靜置3h后,3000r/min×30min離心,分離血清,檢測各項血清學(xué)指標。6不同年份、不同組織hyp、alb的測定6.1一般情況包括大鼠的死亡情況,體重、肝臟大體形態(tài)、肝臟及脾臟重量等。6.2肝組織切片HE及膠原染色觀察肝臟組織學(xué)變化。6.3肝組織膠原纖維增生程度分期0期:正常肝臟,無明顯膠原纖維增生;Ⅰ期:膠原纖維增生,中央靜脈和門脈區(qū)有少量星狀膠原纖維束放散,但無間隔形成;Ⅱ期:膠原纖維增生,中央靜脈和門脈區(qū)結(jié)締組織變厚,由此向四周伸出纖維索,形成不完全間隔;Ⅲ期:膠原纖維大量增生,有個別菲薄的完全間隔形成,或較厚的不完全間隔即將形成假小葉;Ⅳ期:完全纖維間隔,假小葉形成。6.4肝組織Hyp含量測定采用Jamall等的方法。6.5肝功能血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性,采用賴氏法;血清白蛋白(Alb)含量,采用溴甲酚綠法;血清總膽紅素(TBIL)含量,采用重氮法;血清谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶(GGT)活性,按試劑盒說明方法測定。7單因素方差分析計量資料采用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5中的ANOVA程序進行單因素方差分析,q檢驗,并用LSD進行兩兩比較,等級資料采用Ridit分析。結(jié)果1組大鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)變化情況比較藥物干預(yù)治療前模型組大鼠死亡5只,干預(yù)治療后黃芪湯組和小柴胡湯組各死亡1只。造模初期模型大鼠體重仍有所增加,3周后逐漸下降,與同期正常大鼠比較差異有顯著性(P<0.01);肝指數(shù)呈8周最高12周降低的趨勢,但均顯著高于同期正常組大鼠(P<0.01);脾指數(shù)逐漸增加,與同期正常大鼠比較差異有顯著性(P<0.01);與12周模型對照組比較,下瘀血湯、一貫煎、黃芪湯組大鼠體重有所增加,且下瘀血湯組脾指數(shù)降低,但差異無顯著性(P>0.05)。2大鼠肝臟病理組織病理學(xué)檢測造模結(jié)束時正常組大鼠肝臟表面光滑,紅潤柔軟。與正常大鼠比較,模型組大鼠肝臟縮小,呈淡黃色,表面呈小結(jié)節(jié)狀改變,結(jié)節(jié)分布較均勻,質(zhì)地變硬。與模型對照大鼠比較,下瘀血湯組、一貫煎組、黃芪湯組肝臟較大,呈淡黃色,表面較光滑,無明顯結(jié)節(jié)狀改變,質(zhì)地較柔軟;茵陳蒿湯組、小柴胡湯組無明顯變化。3大鼠肝臟脂肪變性的比較HE染色顯示正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列。與正常大鼠比較,4周后模型大鼠可見以中央靜脈為中心的肝細胞脂肪變性,匯管區(qū)周圍未受損的肝細胞呈孤立的島狀結(jié)構(gòu),可見極菲薄的膠原纖維在脂肪變性區(qū)域伸展。8周后,模型大鼠肝細胞脂肪變性累及整個肝小葉,可見較細的膠原纖維形成不完全包繞,間隔內(nèi)可見較多的成纖維細胞,少量炎性細胞浸潤,大膽管損害明顯,小膽管增生。12周后,正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失,大量的纖維結(jié)締組織增生,形成大小不一的典型假小葉結(jié)構(gòu),部分假小葉內(nèi)可見新生幼稚的肝細胞,間隔內(nèi)可見大量的成纖維細胞和炎性細胞浸潤,極少見正常的膽管樣結(jié)構(gòu),小膽管增生明顯。與12周模型對照組比較,下瘀血湯組、一貫煎組大鼠肝細胞脂肪變性程度較輕,完整的假小葉結(jié)構(gòu)少見,膽管損害程度輕,小膽管增生程度低;黃芪湯組纖維結(jié)締組織較疏松;茵陳蒿湯組、小柴胡湯組肝組織病理無明顯改善。天狼星紅膠原染色顯示正常大鼠僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維。4周模型大鼠膠原纖維呈星芒狀在脂肪變區(qū)域伸展,中央靜脈管壁明顯增厚。8周模型大鼠纖維間隔增厚,少數(shù)向小葉內(nèi)延伸,極少部分形成較疏松的纖維包繞肝細胞。12周模型大鼠纖維間隔增寬致密,形成大小不一的完整假小葉結(jié)構(gòu)。與12周模型組比較,下瘀血湯組、一貫煎組纖維間隔明顯減少,少見完整包繞假小葉結(jié)構(gòu);黃芪湯組纖維間隔較疏松;茵陳蒿湯組、小柴胡湯組無明顯改善。4hyp及肝臟膠原增長率見表1。與正常大鼠比較,4、8、12周時模型大鼠肝組織Hyp含量均顯著升高(P<0.01),且12周顯著高于4、8周模型對照組(P<0.01)。與12周模型對照組比較,下瘀血湯組、一貫煎組、黃芪湯組Hyp含量顯著降低(P<0.05,P<0.01);茵陳蒿湯組、小柴胡湯組也有一定的降低趨勢,但差異均無顯著性(P>0.05)。Ridit分析亦顯示,模型對照組12周較4周、8周膠原增生程度顯著加重;下瘀血湯組、一貫煎組、黃芪湯組肝臟膠原增生程度較12周模型對照組顯著減輕;茵陳蒿湯組、小柴胡湯組差異無顯著性。5對血清alb、alt、ast、見表2。與正常組比較,隨著造模時間的延長,模型對照組大鼠ALT、AST、GGT、TBIL逐漸升高,12周時達到高峰,且AST、GGT、TBIL顯著高于4周、8周模型對照組(P<0.01);血清Alb含量逐漸降低,12周時顯著低于4、8周模型對照組(P<0.01)。與12周模型對照組比較,下瘀血湯組和一貫煎組AST、GGT、TBIL、Alb顯著改善(P<0.05,P<0.01),且下瘀血湯組ALT顯著降低(P<0.05);茵陳蒿湯組ALT、AST、GGT顯著降低(P<0.05,P<0.01);黃芪湯組AST顯著降低(P<0.05);小柴胡湯組各項指標差異均無顯著性(P>0.05)。不同功效提取物中醫(yī)證候病機比較本實驗動態(tài)觀察了CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝功能及肝組織學(xué)的變化,結(jié)果顯示,4、8、12周模型大鼠血清AST/ALT比值分別為1.09、1.13與1.32,總膽紅素含量4周時無明顯變化,8周及12周分別增加2.13倍與4.61倍,GGT活性4周時略有上升,8周及12周分別增加5.19倍與7.78倍,血清Alb含量呈梯級降低,分別降至正常大鼠的87%、80%及66%,而反映纖維結(jié)締組織增生的Hyp含量分別增加了0.598倍、1.36倍及3.18倍,結(jié)合肝組織學(xué)觀察表明,4周模型主要表現(xiàn)為急性肝損傷,8周時為慢性肝損傷肝纖維化,而12周則已形成肝硬化;即8~12周這一階段的病理改變主要表現(xiàn)為肝實質(zhì)損傷的進一步加重與肝纖維化的快速發(fā)展,這也是本研究不同功效方劑中醫(yī)證候病機的病理基礎(chǔ)。在肝硬化成型期于CCl4繼續(xù)刺激的同時,予以4種不同功效的中醫(yī)方劑干預(yù)治療(用藥4周)至12周末,下瘀血湯組和一貫煎組肝組織病理改變明顯減輕,肝組織Hyp含量顯著下降,肝功能顯著改善,其中尤以下瘀血湯的干預(yù)治療作用為著,顯示這一階段肝內(nèi)纖維結(jié)締組織的快速增生以及由此引起的組織結(jié)構(gòu)改建是下瘀血湯發(fā)揮作用、血瘀阻絡(luò)方證病機的主要病理基礎(chǔ)。而肝細胞是機體Alb的唯一合成細胞,提示這一階段的肝實質(zhì)嚴重受損,是養(yǎng)陰的一貫煎發(fā)揮效應(yīng)、肝陰虛損方證病機的又一病態(tài)表現(xiàn);而兩個不同功效