第九章酶免疫技術(shù)

第九章酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)一、酶和酶作用底物二、酶標(biāo)記抗體或抗原三、固相載體第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類(lèi)一、均相酶免疫測(cè)定二、非均相酶免疫測(cè)定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理二、方法類(lèi)型及反應(yīng)原理思考題小結(jié)放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)

主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：

免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專(zhuān)一性原理及特點(diǎn)特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析

原理及特點(diǎn)標(biāo)記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專(zhuān)一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉

一、酶和酶作用底物辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無(wú)關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶常用酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測(cè)定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱(chēng)為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專(zhuān)一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常見(jiàn)底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見(jiàn)底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

二、酶標(biāo)記抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

制備方法要求酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法要求技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法過(guò)碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。

酶標(biāo)記抗體或抗原純化及鑒定標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度

常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過(guò)柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

三、固相載體要求

結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進(jìn)行固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類(lèi)塑料制品

微顆粒膜載體

固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking包被與封閉

第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類(lèi)

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相非均相固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定

酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫測(cè)定最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測(cè)定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測(cè)定EMIT示意圖CEDIA示意圖分類(lèi)：液相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測(cè)定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物二、非均相酶免疫測(cè)定

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個(gè)必要試劑

二、方法類(lèi)型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測(cè)抗原的方法1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無(wú)抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競(jìng)爭(zhēng)法

方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測(cè)抗原的方法洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE間接法方法

用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定ELISA檢測(cè)抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無(wú)抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類(lèi)似雙抗體夾心法操作步驟：類(lèi)似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法競(jìng)爭(zhēng)法原理：類(lèi)似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè)ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類(lèi)抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色

洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合，加底物不顯色

第四節(jié)

酶免疫測(cè)定的應(yīng)用

均相酶免疫測(cè)定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。非均相免疫測(cè)定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門(mén)螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測(cè)，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。1．酶免疫技術(shù)的要點(diǎn)？2．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理（ELISA）？3．競(jìng)爭(zhēng)法在酶聯(lián)免疫檢測(cè)應(yīng)用中的原理和應(yīng)用？4．常用的底物有哪幾類(lèi)？特點(diǎn)？5．常用的酶有哪幾類(lèi)？特點(diǎn)？6．何謂包被與封閉？其作用？7．常用固相載體的種類(lèi)和特點(diǎn)？8．舉例固相酶免疫測(cè)定應(yīng)用的原理及影響因素。9．ELISA的非特異性干擾有哪些，其機(jī)制？10．對(duì)酶免疫技術(shù)的應(yīng)用評(píng)價(jià)如何？思考題酶免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種，它是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測(cè)方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過(guò)酶對(duì)底物的作用進(jìn)一步提高敏感性。酶免疫技術(shù)可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測(cè)定兩大類(lèi),后者根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和非均相兩種類(lèi)型。均相酶免疫測(cè)定主要用于小分子激素和半抗原的測(cè)定，非均相酶免疫測(cè)定根據(jù)是否使用固相支持物，又可分為液相和固相酶免疫測(cè)定兩種類(lèi)型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,其原理可以有夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法和捕獲法等。小結(jié)愛(ài)是什么？

一個(gè)精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無(wú)。

一只鳥(niǎo)兒飛過(guò)來(lái)，停在枝上，望著遠(yuǎn)處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問(wèn)道：“你愛(ài)這稻谷嗎？”

“愛(ài)。”

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓?！?/p>

鳥(niǎo)兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤(rùn)的羽毛。

“現(xiàn)在你愛(ài)這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥(niǎo)兒抬頭望著遠(yuǎn)處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛(ài)那一灣泉水，我有點(diǎn)渴了。”

精靈摘下一片樹(shù)葉，里面盛了一汪泉水。

鳥(niǎo)兒喝完泉水，準(zhǔn)備振翅飛去。

“請(qǐng)?jiān)倩卮鹞乙粋€(gè)問(wèn)題，”精靈伸出指尖，鳥(niǎo)兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水?！?/p>

“我要去那片開(kāi)著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤(rùn)你的干渴？”

“不能?！睈?ài)是什么？

一個(gè)精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無(wú)。

一只鳥(niǎo)兒飛過(guò)來(lái)，停在枝上，望著遠(yuǎn)處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問(wèn)道：“你愛(ài)這稻谷嗎？”

“愛(ài)?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓。”

鳥(niǎo)兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤(rùn)的羽毛。

“現(xiàn)在你愛(ài)這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥(niǎo)兒抬頭望著遠(yuǎn)處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛(ài)那一灣泉水，我有點(diǎn)渴了?！?/p>

精靈摘下一片樹(shù)葉，里面盛了一汪泉水。

鳥(niǎo)兒喝完泉水，準(zhǔn)備振翅飛去。

“請(qǐng)?jiān)倩卮鹞乙粋€(gè)問(wèn)題，”精靈伸出指尖，鳥(niǎo)兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水?！?/p>

“我要去那片開(kāi)著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤(rùn)你的干渴？”

“不能。”愛(ài)是什么？

一個(gè)精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無(wú)。

一只鳥(niǎo)兒飛過(guò)來(lái)，停在枝上，望著遠(yuǎn)處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問(wèn)道：“你愛(ài)這稻谷嗎？”

“愛(ài)?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓?！?/p>

鳥(niǎo)兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤(rùn)的羽毛。

“現(xiàn)在你愛(ài)這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥(niǎo)兒抬頭望著遠(yuǎn)處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛(ài)那一灣泉水，我有點(diǎn)渴了。”

精靈摘下一片樹(shù)葉，里面盛了一汪泉水。

鳥(niǎo)兒喝完泉水，準(zhǔn)備振翅飛去。

“請(qǐng)?jiān)倩卮鹞乙粋€(gè)問(wèn)題，”精靈伸出指尖，鳥(niǎo)兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水。”

“我要去那片開(kāi)著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子。”

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤(rùn)你的干渴？”

“不能?！睈?ài)是什么？

一個(gè)精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無(wú)。

一只鳥(niǎo)兒飛過(guò)來(lái)，停在枝上，望著遠(yuǎn)處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問(wèn)道：“你愛(ài)這稻谷嗎？”

“愛(ài)?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓。”

鳥(niǎo)兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤(rùn)的羽毛。

“現(xiàn)在你愛(ài)這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥(niǎo)兒抬頭望著遠(yuǎn)處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛(ài)那一灣泉水，我有點(diǎn)渴了?！?/p>

精靈摘下一片樹(shù)葉，里面盛了一汪泉水。

鳥(niǎo)兒喝完泉水，準(zhǔn)備振翅飛去。

“請(qǐng)?jiān)倩卮鹞乙粋€(gè)問(wèn)題，”精靈伸出指尖，鳥(niǎo)兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水?！?/p>

“我要去那片開(kāi)著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子。”

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤(rùn)你的干渴？”

“不能?！?/p>

其實(shí)，世上最溫暖的語(yǔ)言，“不是我愛(ài)你，而是在一起。”

所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以誠(chéng)相待，彼此尊重，相互包容，相互懂得，才能走的更遠(yuǎn)。相遇是緣，相守是愛(ài)。緣是多么的妙不可言，而懂得又是多么的難能可貴。否則就會(huì)錯(cuò)過(guò)一時(shí)，錯(cuò)過(guò)一世！擇一人深?lèi)?ài)，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牽，一路笑對(duì)風(fēng)雨。在平凡的世界，不求愛(ài)的轟轟烈烈；不求誓言多么美麗；唯愿簡(jiǎn)單的相處，真