第九章 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第九章酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第1頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應(yīng)速度受各種因素影響：底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑、抑制劑等。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶反應(yīng)速度的各種因素的科學(xué)。Thestudyofenzymekineticsaddressesthebiologicalrolesofenzymaticcatalystsandhowtheyaccomplishtheirremarkablefeats.意義？第2頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)概念一、反應(yīng)速率：單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物的濃度變化，通常用瞬時(shí)速率表示反應(yīng)速率。V=-dc/dt，負(fù)號表示反應(yīng)物濃度的減小；或v=+dc/dt二、反應(yīng)分子數(shù)：是在反應(yīng)中真正相互作用的分子數(shù)目。一般為單分子反應(yīng)，2分子反應(yīng)，3分子少見，大于3分子未發(fā)現(xiàn)。第3頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月元素衰變，分子重排，異構(gòu)體互變是單分子反應(yīng)，符合：v=dc/dt=kc,其中c為mol/l,k是比例常數(shù)，謂之反應(yīng)速率常數(shù)。單位：s-1雙分子反應(yīng)很多，符合v=dc/dt=kc1c2,c1,c2分別代表兩種反應(yīng)物的濃度。即與A、B成正比第4頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月三、反應(yīng)級數(shù)：根據(jù)整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率方程式，則這個(gè)反應(yīng)即為幾級反應(yīng)。如果反應(yīng)速率能用單分子反應(yīng)的速率方程式表示，該反應(yīng)即為一級反應(yīng)；反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無關(guān)的反應(yīng)謂之零級反應(yīng)。凡是反應(yīng)速率能用雙分子速率方程描述，則為二級反應(yīng)。第5頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月但還需要區(qū)別對待，如蔗糖水解：蔗糖+H2O葡萄糖+果糖，由于稀溶液水比蔗糖多的多，故可以視為一級反應(yīng)。故反應(yīng)速率只決定于蔗糖濃度：v=kcsucrose。四、各級反應(yīng)的特征:一級反應(yīng)：反應(yīng)速率只與反應(yīng)物濃度一次方成正比的反應(yīng)。t1/2為一般反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物所需要的時(shí)間，謂之半衰期一級反應(yīng)半衰期與初始濃度無關(guān)，與速率常數(shù)成反比。第6頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月二級反應(yīng)：反應(yīng)物濃度二次方或兩個(gè)反應(yīng)物濃度乘積成正比的反應(yīng)。最常見的反應(yīng)。二級反應(yīng)半衰期與初始濃度成反比，即初始濃度越大則半衰期越短，這是二級反應(yīng)的重要特征。零級反應(yīng)速率與初始濃度無關(guān)，半衰期與初始濃度成正比，即初始濃度越高，則半衰期越長。第8頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)底物濃度對反應(yīng)速率的影響一、中間復(fù)合物學(xué)說Henri1903年蔗糖酶水解實(shí)驗(yàn)：酶濃度不變，改變底物濃度，開始為一級反應(yīng)，中間為混合級反應(yīng)，最后，底物濃度無論如何增加，反應(yīng)速率不再增加，為零級反應(yīng)。表明酶可以被飽和，形成中間產(chǎn)物：S+EESP+E。正比關(guān)系非正比不再增加速率第9頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月底物對酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象第10頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月證據(jù)：

EM和X-raydiffractionobservation，如DNApolymeraseI；熒光光譜的變化p356；物理性質(zhì)如溶解度在形成復(fù)合物后產(chǎn)生變化；分離得到胰凝乳蛋白酶和底物復(fù)合物的結(jié)晶；透析和超速離心證據(jù)第11頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。

1925,BriggsandHaldane修正：根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:第12頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月總的酶量第15頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,

Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。單位是mol/L第16頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2.動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義

米氏常數(shù)的意義：1）它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)，其大小與酶的性質(zhì)有關(guān)而與酶濃度無關(guān)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。2)Km可以判斷酶的專一性和天然底物。一個(gè)酶有幾個(gè)底物，就由幾個(gè)Km，其中Km最小的底物為其最適底物，即天然底物。第18頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月3）根據(jù)Km=(k2+k3)/k1,若k3<<k2時(shí)，Km=Ks，則ES分解即為反應(yīng)的限速步驟，此時(shí)，Km值表示酶與底物之間的親和程度：成反比關(guān)系，Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。4）如果已知Km，可以計(jì)算某一底物濃度下，反應(yīng)速率相當(dāng)于Vmax的百分率，生產(chǎn)上，底物濃度太小，不經(jīng)濟(jì)，太大浪費(fèi)底物。當(dāng)v=Vmax時(shí)，反應(yīng)速率與[E0]成正比，如果某一酶Km已知，則任何底物下，酶被底物飽和百分?jǐn)?shù)為：fES=v/Vmax=[S]/(Km+[S])第19頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月5)根據(jù)Km大小，可以判斷某一代謝途徑的方向和途徑。GDH之NAD+Km=2.5x10-5；NADH為1.8x10-5對于一系列反應(yīng)來說，Km大小可以判斷反應(yīng)的限速步驟。6)可用于判斷反應(yīng)級數(shù)：當(dāng)[S]<0.01Km時(shí)，反應(yīng)為一級反應(yīng)；當(dāng)[S]>100Km時(shí)，ν=Vmax，反應(yīng)為零級反應(yīng)；當(dāng)0.01Km<[S]<100Km時(shí)，為混合級反應(yīng)。

Vmax的意義：同一種酶，但底物不同，則Vmax也不同，并且受pH，溫度，離子強(qiáng)度的影響。第20頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)S很大時(shí)，Vmax=k3[E]，此時(shí)，酶被底物飽和，k3表示酶被底物飽和時(shí)，每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，又謂之轉(zhuǎn)換數(shù)（TN），又常常被稱為催化常數(shù)kcat.kcat數(shù)值越大，則酶的催化效率越高。生理?xiàng)l件下，大多數(shù)酶不會(huì)被底物所飽和，[S]/Km一般介于0.01-0.1之間，根據(jù)Vmax=k3[ET]=kcat[ET],當(dāng)[S]<<Km,則有：顯然kcat/Km是E和S反應(yīng)形成產(chǎn)物的二級速率常數(shù)。第21頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Km和Vmax的求法，米氏方程的作圖：基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。ByrearrangementsoftheM-Meq,thehyperbolicCurvecanbetransformedintoastraight-lineequation.Thesetransformationinclude(1)theLineweaver-Burkdouble-reciprocalplot,thebestknowtransformation1v=KmVmax1[S]Vmax1+第22頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)AnotherrearrangementoftheM-MequationistheHanes-Woolfplotbymultiplyingtheequationby[S]givesGraphing[s]/vvs[S]yieldsastraightlinewheretheslopeis1/Vmax,they-interceptis

Km/Vmax,andthex-interceptis–Km.第24頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的Km在實(shí)際應(yīng)用中的意義鑒定酶：通過測定Km，可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。判斷酶的最適底物（天然底物）。計(jì)算一定速度下底物濃度。了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平。判斷反應(yīng)方向或趨勢。判斷抑制類型三、多底物反應(yīng)酶促動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)有單底物，雙底物和三底物三種類型p364如果是：A+BP+Q，是最重要的類型按照反應(yīng)機(jī)制，多底物反應(yīng)分為：1.序列反應(yīng)(sequentialreaction)，即底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放有一定的順序：第26頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月有序反應(yīng)orderedreactions,OrderedBiBi

隨機(jī)反應(yīng)：randomreactions,Random,BiBi乙醇脫氫酶肌酸激酶第27頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2.乒乓反應(yīng)PingPangreactions特點(diǎn)是在酶同A的反應(yīng)產(chǎn)物P是在酶同第二個(gè)底物B反應(yīng)前釋放出來，酶變?yōu)樾揎椕窫’，再同底物B反應(yīng)生成產(chǎn)物Q，酶恢復(fù)原狀。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶第28頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)酶的抑制作用1.酶的失活作用：指使酶蛋白變性二導(dǎo)致的酶活性喪失作用。定義：在一定的物理化學(xué)或生物因素作用下，使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。抑制劑并非變性劑，抑制劑具有不同程度的選擇性。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：

a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。

b.能夠與酶以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。第29頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月一、抑制作用的類型

非專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑定義：酶必需基團(tuán)與抑制劑共價(jià)結(jié)合不能以透析、超濾等物理方法使酶活性恢復(fù)[E]

不可逆抑制劑第30頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭性抑制劑可逆抑制劑非競爭性抑制劑反競爭性抑制劑可逆抑制劑和不可逆抑制劑的區(qū)別：

非共價(jià)；動(dòng)力學(xué)：以v對[E]作圖，不可逆抑制劑曲線整體向右移動(dòng)，可逆抑制劑速率降低。其特點(diǎn)是抑制劑與酶活性基團(tuán)非共價(jià)結(jié)合，可以使用透析或超濾的方法使酶活性恢復(fù)，是可逆的Doseeffect第31頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月四、可逆抑制作用動(dòng)力學(xué)1.競爭性抑制：抑制劑與底物競爭與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為競爭性抑制作用。

Km變大，Vmax不變第32頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第33頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)：⑴競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；⑵抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減小；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vmax值不變。例子：磺胺類藥物等對氨基苯甲酸對氨基苯磺酰胺第34頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非競爭性抑制劑noncompetitiveinhibition,抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。Vm[S]·v=(Km+[S])(1+[I]Ki）Km不變，Vmax降低Non-subtractbindingsite第36頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月mixedinhibition,thebindingofIinfluencethebindingofS,whichproduce:第38頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)：⑴非競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vmax值降低。例子：Leu是Arg合成酶的非競爭性抑制劑，某些重金屬離子對酶的抑制作用如：Ag+,Cu2+,Pb2+,Hg2+3.反競爭性抑制uncompetitiveinhibition抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。第39頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月Km變小，Vmax變小第40頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)：⑴反競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vmax降低。例子：肼類化合物抑制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酯酶。KIandKI’Alsofinditinp373第41頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月五、重要的抑制劑1.不可逆抑制作用：（1)非專一性不可逆抑制劑：有機(jī)磷-與酶活性中心Ser羥基結(jié)合。膽堿酯酶；有機(jī)汞、砷-作用與Cys之巰基，如路易斯毒氣；重金屬：蛋白變性失活；烷化試劑，多種基團(tuán)；氰化物、硫化物和CO與酶的金屬離子作用；青霉素：與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性中心ser殘基結(jié)合第42頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)專一性不可逆抑制劑：

Ks型不可逆抑制劑，具有底物類似結(jié)構(gòu)，與酶專一性結(jié)合，其含有的活潑化學(xué)基團(tuán)，可以對酶活性中心進(jìn)行化學(xué)修飾，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。由于抑制是通過對酶的親和力來對酶進(jìn)行修飾標(biāo)記的，故稱之為親和標(biāo)記試劑affinitylabelingreagent.第44頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月

Kcat型不可逆抑制劑:抑制劑不但具有天然底物的類似結(jié)構(gòu)，本身也是酶的底物，酶與之結(jié)合后，導(dǎo)致抑制劑潛伏反應(yīng)基團(tuán)暴露或活化，并與酶活性中心必需基團(tuán)作用，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。專一性極高，謂之自殺性底物。第45頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2.可逆抑制劑5FU抑制胸腺嘧啶合成酶；磺胺類藥物二氫葉酸合成酶過渡態(tài)類似物：烯醇式丙酮酸是LDH，ODH，PC催化過程的過渡態(tài)，草酸是烯醇式丙酮酸的類似物，