以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件

以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之醱酵產(chǎn)氫

以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之醱酵產(chǎn)氫1

摘要本研究以產(chǎn)製麩胺酸的副產(chǎn)物－濃縮糖蜜醱酵廢液(condensedmolassesfermentationsoluble)為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)的產(chǎn)氫試驗(yàn)，分別探討基質(zhì)濃度(substrateconcentration,Cs)及水力停留時(shí)間(hydraulicretentiontime,HRT)對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)氫之影響，並藉分子生物技術(shù)分析反應(yīng)器菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，系統(tǒng)可於HRT6h(Cs=40gCOD/L)成功啟動(dòng)，產(chǎn)氫速率、氫氣產(chǎn)率分別可達(dá)5.01L/L/d及1.19molH2/molhexose，但隨操作的持續(xù)進(jìn)行，系統(tǒng)之產(chǎn)氫效能發(fā)生週期性升降的現(xiàn)象，致使系統(tǒng)呈現(xiàn)不穩(wěn)定操作的現(xiàn)象；即使將HRT降為4h及基質(zhì)濃度增為70gCOD/L亦無(wú)法有效改善此問(wèn)題，然而透過(guò)基質(zhì)預(yù)熱策略(60oC,1h)則可明顯改善此問(wèn)題，於HRT4h及基質(zhì)濃度70gCOD/L(總糖濃度17.7g/L)之條件，產(chǎn)氫速率及氫氣產(chǎn)率分別可達(dá)17.8Nm3/m3/d及1.64molH2/molhexose。菌群結(jié)構(gòu)分析顯示，基質(zhì)預(yù)熱可使原存於系統(tǒng)中之Corynebacteriumglutamicum(生產(chǎn)麩胺酸之工業(yè)用菌株)逐漸消失並優(yōu)勢(shì)化Clostridiumsp.，因而提升系統(tǒng)之產(chǎn)氫效能，使系統(tǒng)由不利於產(chǎn)氫之乳酸醱酵轉(zhuǎn)變成有利於產(chǎn)氫之丁酸醱酵。另外，基質(zhì)預(yù)熱操作後約10天，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中存在可分解醣類(lèi)及乳酸而產(chǎn)生氫氣之Megasphaerasp.，由液相代謝物組成之乳酸含量降低推測(cè)其對(duì)於產(chǎn)氫具有相當(dāng)程度的貢獻(xiàn)。

摘要2

一、前言

氫氣燃燒使用後只產(chǎn)生水，並無(wú)污染之虞，應(yīng)用於燃料電池(fuelcell)發(fā)電具有高能源轉(zhuǎn)換效率，因此被期許為未來(lái)的能源主流之一(Levinetal.,2004)，而如何以高經(jīng)濟(jì)效益的方法獲取氫氣實(shí)為當(dāng)今重要的課題。相對(duì)於高溫高壓之熱化學(xué)法(thermochemicalmethod)產(chǎn)氫，生物產(chǎn)氫可於常溫常壓下轉(zhuǎn)換有機(jī)物獲取氫氣，不僅具低耗能的特點(diǎn)，應(yīng)用於有機(jī)廢棄物處理則兼具能源再生及生態(tài)循環(huán)之功能(李等，2007)。生物產(chǎn)氫可分為光合作用(photosynthesis)與醱酵作用(fermentation)兩大類(lèi)。光合作用是以藻類(lèi)(algae)或藍(lán)綠細(xì)菌(cyanobacteria)等在光照下進(jìn)行水的分解(biophotolysis)而產(chǎn)生氫氣(Asada&Miyake,1999)。醱酵作用則利用光合菌或厭氧菌進(jìn)行有機(jī)物的醱酵轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生氫氣，其中光合菌醱酵產(chǎn)氫因需藉光能而稱(chēng)為光醱酵作用(photofermentation)(Asada&Miyake,1999)，相對(duì)的厭氧菌醱酵產(chǎn)氫因不需光能而稱(chēng)為暗醱酵作用(darkfermentation)(Lin&Chang,1999)。相對(duì)於光醱酵作用，暗醱酵因具有較高的產(chǎn)氫速率及不受日光限制等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)逐漸受到世界各國(guó)的重視與期待(Levinetal.,2004)，其產(chǎn)氫菌包括Enterobacter、Bacillus及Clostridium等菌屬(李等，2007)。

一、前言

3二、材料與方法2.1產(chǎn)氫菌的來(lái)源及篩選本研究使用之污泥取自雲(yún)林縣臺(tái)西鄉(xiāng)海岸潮間帶之污泥。取回之污泥先以95-100oC熱處理(Linetal.,2000)維持1小時(shí)，以去除甲烷菌等耗氫菌。並於實(shí)驗(yàn)室以糖蜜醱酵廢液進(jìn)行產(chǎn)氫菌之馴養(yǎng)，以獲得具優(yōu)勢(shì)產(chǎn)氫菌之植種菌液。二、材料與方法42.2產(chǎn)氫料源產(chǎn)氫料源取自味丹企業(yè)股份有限公司的濃縮糖蜜醱酵廢液，糖蜜廢液為該公司生產(chǎn)味精時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，溶解性COD約為400gCOD/L，總糖含量約為100g/L，由於糖蜜廢液含有豐富的營(yíng)養(yǎng)鹽供給微生物生長(zhǎng)，因此未額外添加其他營(yíng)養(yǎng)鹽及微量金屬，進(jìn)料時(shí)僅依設(shè)計(jì)濃度將糖蜜廢液稀釋至所需濃度，並添加適量Na2CO3作為緩衝劑。以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件5

實(shí)驗(yàn)方法

本研究以有效體積400L的CSTR反應(yīng)器進(jìn)行產(chǎn)氫操作，系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)先於反應(yīng)器內(nèi)植入60L經(jīng)糖蜜廢液馴養(yǎng)的產(chǎn)氫菌液及340L培養(yǎng)基(40gCOD/L)，充分混合後曝以氬氣使系統(tǒng)呈現(xiàn)厭氧狀態(tài)並於37℃進(jìn)行批次培養(yǎng)，待菌體活化後即以水力停留時(shí)間(hydraulicretentiontime,HRT)6h進(jìn)行系統(tǒng)之啟動(dòng)，隨後並於進(jìn)行各種不同基質(zhì)濃度(40-70gCOD/L)與HRT(6-4h)之產(chǎn)氫試驗(yàn)，其培養(yǎng)溫度及pH分別控制於為37℃及5.5，並於實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)pH、ORP值變化，操作過(guò)程所產(chǎn)生之氣體則經(jīng)GasMeter計(jì)算其產(chǎn)氣量。

實(shí)驗(yàn)方法

本研究以有效體積400L的CSTR反應(yīng)器進(jìn)行6

氣體組成分析

以氣相層析儀(CHINAChromatograph8700T)進(jìn)行氣體組成分析，使用之偵測(cè)器為熱傳導(dǎo)偵測(cè)器(thermalconductivitydetector,TCD)，載體(carriergas)為氬氣，管柱為1/8mmID*4m不鏽鋼管，注射口溫度175oC，偵測(cè)器溫度100oC，管柱溫度55oC。

氣體組成分析

以氣相層析儀(CHINAChromato72.4.2液相組成分析以液相層析儀(SHIMADZULC-10ATLiquidChromatograph)進(jìn)行溶解性代謝物(solublemicrobialproduct,SMP)組成分析，使用之偵測(cè)器為折射率偵測(cè)器(refractiveindexdetector,RID)，使用的管柱(column)為COREGEL87H3，其移動(dòng)項(xiàng)(mobilephase)為0.005NH2SO4，溫度為35℃，流速為0.6mL/min。2.4.3水質(zhì)分析化學(xué)需氧量(chemicaloxygendemand,COD)以及揮發(fā)性懸浮固體物(volatilesuspendedsolid,VSS)皆依據(jù)水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)方法(APHA,1997)檢測(cè)之。總糖濃度以酚-硫酸法(phenol-sulfuricacidmethod)測(cè)定(Duboisetal.,1956)。2.4.4掃描式電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察樣本之製備取自反應(yīng)器內(nèi)之菌液先以玻璃纖維濾紙過(guò)濾，而後將含菌體的濾紙置於2.5%的戊二醛溶液中浸泡3小時(shí)以上以進(jìn)行菌體之固定，隨後再依序浸於濃度為50%、70%、80%、90%、95%的乙醇(ethanol)溶液中各30分鐘，再將樣本置換到100%乙醇溶液中保持脫水狀態(tài)，後續(xù)乾燥、上檯、鍍膜以及觀察技術(shù)則委託相關(guān)專(zhuān)業(yè)技術(shù)單位，該單位使用機(jī)型為HITACHIS-3000NSEM。以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件82.4.5聚合酶鏈鎖反應(yīng)將污泥樣品中所萃取出的微生物DNA進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)，依據(jù)不同的分析目標(biāo)設(shè)計(jì)各自專(zhuān)一性的引子(primer)，此引子為一段與DNA片段互補(bǔ)的序列，經(jīng)反應(yīng)後可放大特定目標(biāo)之DNA片段，則所合成的DNA片段便可用以作為後續(xù)鑑定菌群之依據(jù)。PCR反應(yīng)所需的混合試劑PCRmastermix2X(Promega,USA)，成分包含：25units/mlTaqDNAPolymerase、200μMdNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)和1.5mMMgCl2，以及引子各0.2μM與適量templateDNA，利用聚合酶連鎖反應(yīng)器iCycleTMThermalCycler(Bio-Rad,USA)操作在三種溫度下循環(huán)以利用酵素進(jìn)行DNA合成。本研究所使用的引子及接合溫度(Ta)如表1所示。PCR反應(yīng)結(jié)束後，利用瓊脂膠糖明膠電泳(Agarosegel)確定其產(chǎn)物長(zhǎng)度以判斷產(chǎn)物是否正確。依據(jù)不同長(zhǎng)度之產(chǎn)物配置適當(dāng)濃度的膠體(表2)，將PCR產(chǎn)物與loadingdye依比例混合後，以100伏特電壓進(jìn)行電泳，待loadingdye移動(dòng)至膠體底部的三分之一時(shí)停止電泳。最後將膠體浸入含0.5μg/mL之EthidiumBromide染色10分鐘後，以紫外光顯像並拍照。以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件92.4.6變性梯度明膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)主要針對(duì)的目標(biāo)在於序列長(zhǎng)度相同而鹼基組成不同的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，其靈敏度最高可區(qū)分出一個(gè)鹼基差別的DNA片段，藉此可判別出屬於不同specie甚至不同strain的菌株。配製具有變性劑濃度梯度的膠體，藉由不同濃度變性劑所提供之能量強(qiáng)弱不同，打斷構(gòu)成雙股DNA結(jié)構(gòu)能力的氫鍵，使DNA變性；樣本經(jīng)由DGGE分析後，在電泳膠片上所呈現(xiàn)多個(gè)不同位置之亮帶即代表不同DNA序列，藉由分析電泳膠片上之亮帶多寡與位置的差異，來(lái)瞭解系統(tǒng)中微生物族群的多樣性程度。配製變性梯度膠時(shí)，首先準(zhǔn)備變性梯度之最高及最低變性劑濃度(high/lowdenaturedensitysolution)，以gradientformer(BioRad)進(jìn)行變性梯度膠體之配製，並使用變性梯度凝膠電泳槽(DcodegeneSystem,Bio-Rad)，以80伏特電壓及60oC條件下進(jìn)行電泳12h，最後利用Ethidium以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件10Acrylamide/Bis膠體之DNA純化以引子968f-gc/1392r進(jìn)行16SrDNA放大之PCR產(chǎn)物，經(jīng)由DGGE分析後，再將DGGE膠體上相異的band分別切下後置於無(wú)菌水中，以?xún)鋈诜ǐ@取目標(biāo)DNA片段；為檢視切下的band，必須重複進(jìn)行PCR-DGGE與切膠純化的分析直至確定為單一亮帶為止。純化的DNA再利用無(wú)GCclamp的引子組(例968f&1392r)將DNA放大後，即可將DNA做其後續(xù)研究或送交生技公司進(jìn)行定序，再將其定序結(jié)果經(jīng)由NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網(wǎng)站所提供NucleotideBlast服務(wù)進(jìn)行菌種DNA序列比對(duì)。以糖蜜廢液為料源進(jìn)行400L模場(chǎng)規(guī)模之酦酵產(chǎn)氫課件11三、結(jié)果與討論系統(tǒng)啟動(dòng)為了縮短系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)程，本研究以HRT6h來(lái)啟動(dòng)系統(tǒng)。反應(yīng)器首先植種約60L之產(chǎn)氫污泥，並置入約340L糖蜜廢液作為培養(yǎng)基(40gCOD/L)，充分混合後充以氬氣使系統(tǒng)呈厭氧狀態(tài)，並於37℃及pH5.5之條件下進(jìn)行批次培養(yǎng)。待氫氣生成即以基質(zhì)濃度40gCOD/L及HRT6h之條件進(jìn)行系統(tǒng)之啟動(dòng)，啟動(dòng)後氫氣濃度快速攀升至約40%，但僅維持約半日即下降至34%，其產(chǎn)氫速率(H2productionrate,HPR)可達(dá)3.3Nm3/m3/d，約1.5日後，氫氣濃度再度下滑至30%左右，並伴隨產(chǎn)氣量的下降，導(dǎo)致HPR顯著下降至2.3Nm3/m3/d。而後氫氣濃度略下降至27%，致HPR再略下降至約2.0Nm3/m3/d(如圖1)。直至第5日，雖然氫氣濃度仍維持於27%，但由於產(chǎn)氣量的增加導(dǎo)致HPR攀升至3.3Nm3/m3/d。第8日後，氫氣濃度及HPR分別可穩(wěn)定維持於31%及5.0L/L/h，顯示糖蜜廢液醱酵產(chǎn)氫可採(cǎi)用較低的HRT(6h)來(lái)啟動(dòng)，並於啟動(dòng)後約一週逐漸趨於穩(wěn)態(tài)操作。當(dāng)系統(tǒng)操作至第11日時(shí)，由於進(jìn)料幫浦發(fā)生故障，系統(tǒng)被迫停止進(jìn)料，於三、結(jié)果與討論1212小時(shí)內(nèi)修復(fù)後重新啟動(dòng)進(jìn)料，啟動(dòng)後產(chǎn)氫狀態(tài)迅速恢復(fù)，顯示該系統(tǒng)對(duì)進(jìn)流基質(zhì)的擾動(dòng)具有高度的緩衝能力。本啟動(dòng)操作初期，氧化還原電位(oxidationreductionpotential,ORP)約為450~500mV之間，後期產(chǎn)氫較佳狀態(tài)之ORP約為500~580mV，推測(cè)與絕對(duì)厭氧菌Clostridiumsp.逐漸形成優(yōu)勢(shì)產(chǎn)氫菌有關(guān)。本試程穩(wěn)態(tài)操作之生物質(zhì)量濃度為9.1gVSS/L(如表4)，推測(cè)其中部分為糖蜜廢液中原本即含有之生物量所致。此外，穩(wěn)態(tài)操作之基質(zhì)利用率約為72%(如表4)，顯然低於蔗糖產(chǎn)氫之利用率，其原因尚不明，有待進(jìn)一步探討。整體產(chǎn)氫表現(xiàn)而言，產(chǎn)氫速率(HPR)及氫氣產(chǎn)率(H2yield,HY)分別為5.01Nm3/m3/d及1.19molH2/molhexose，其HY約為理論值4.0molH2/molhexose的30%。12小時(shí)內(nèi)修復(fù)後重新啟動(dòng)進(jìn)料，啟動(dòng)後產(chǎn)氫狀態(tài)迅速恢復(fù)，顯示該13四、結(jié)論歸納本研究，模場(chǎng)系統(tǒng)進(jìn)行糖蜜廢液醱酵產(chǎn)氫可於HRT6h(Cs=40gCOD/L)成功啟動(dòng)，產(chǎn)氫速率、氫氣產(chǎn)率分別可達(dá)5.01L/L/d及1.19molH2/molhexose。但長(zhǎng)期操作，系統(tǒng)因原存於料源中的Corynebacteriumglutamicum滋生並競(jìng)爭(zhēng)基質(zhì)，迫使Clostridiumsp.失去優(yōu)勢(shì)，而使系統(tǒng)產(chǎn)氫效能下降。透過(guò)基質(zhì)預(yù)熱策略可明顯抑制Co.glutamicum的生長(zhǎng)，並優(yōu)勢(shì)化Clostridiumsp.，因而改善此不穩(wěn)定操作的問(wèn)題，於HRT4h及基質(zhì)濃度70gCOD/L(總糖濃度17.7g/L)之條件，產(chǎn)氫速率及氫氣產(chǎn)率分別可達(dá)17.8Nm3/m3/d及1.64molH2/molhexose。另外，基質(zhì)預(yù)熱之操作，系統(tǒng)中亦發(fā)現(xiàn)存有可分解醣類(lèi)及乳酸而產(chǎn)生氫氣之厭氧球狀菌Megasphaerasp.，推測(cè)其對(duì)於系統(tǒng)由不利於產(chǎn)氫之乳酸醱酵轉(zhuǎn)變成有利於產(chǎn)氫之丁酸醱酵具有相當(dāng)程度的貢獻(xiàn)。四、結(jié)論歸納本研究，模場(chǎng)系統(tǒng)進(jìn)行糖蜜廢液醱酵產(chǎn)氫可於HRT14

五、參考文獻(xiàn)

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