hplc法測定山核桃外蒲殼中球松素和大黃酚的含量

hplc法測定山核桃外蒲殼中球松素和大黃酚的含量

山核桃是核桃科的一種優(yōu)良菌株。它是中國特有的優(yōu)質(zhì)干果和油樹種。主要分布在浙江和安徽的交匯處山區(qū)。山核桃未成熟時核外部有一層厚厚的綠色外果皮,又叫外蒲殼,隨著山核桃逐漸成熟并被采摘剝離后,該外果皮顏色會漸漸變?yōu)樽丶t色直至黑色。山核桃果實的集約化生產(chǎn)、加工,給農(nóng)民帶來巨大經(jīng)濟效益的同時,棄置野外的山核桃外蒲殼經(jīng)雨水浸泡后,浸出液流入江、河、湖泊中,污染當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境,危及動植物的生存。本實驗在前期對山核桃外蒲殼活性成分研究的基礎(chǔ)上,分離得到大黃酚、球松素等活性成分。球松素又名喬松酮,在生理學(xué)、醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)上都有較高的應(yīng)用價值,其具有廣泛的生理和藥理活性,包括抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、延緩衰老等;大黃酚具有止血和抗衰老等藥理活性。有文獻報道東樂膏、六味安消膠囊中大黃酚含量測定方法和山核桃樹葉中球松素含量測定方法,但目前尚未見用HPLC法測定山核桃外蒲殼中球松素和大黃酚含量的報道。國內(nèi)外對胡桃科很多植物的化學(xué)成分及生物活性有比較全面和深入的研究,但對山核桃外蒲殼化學(xué)成分、生物活性的研究文獻報道很少,尤其是質(zhì)量控制方法方面。本論文從植物化學(xué)、藥理學(xué)及質(zhì)量控制的角度初步研究了山核桃外蒲殼的質(zhì)量控制方法,為給綜合開發(fā)利用山核桃外蒲殼資源提供科學(xué)依據(jù),本實驗建立了HPLC測定山核桃外蒲殼中球松素和大黃酚含量的方法。1儀器、試劑和儀器LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津,SPD-20A紫外檢測器,N2010色譜工作站);BP211D型十萬分之一電子天平(Sartorius);SK3200H型超聲處理器(上海科導(dǎo)超聲儀器公司)等。甲醇(色譜純,MERCK,批號61860725001730);磷酸(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號T20080108);水為娃哈哈純凈水。球松素、大黃酚均為實驗室自制(TLC薄層鑒別,核磁C譜、H譜,質(zhì)譜,紅外光譜進行結(jié)構(gòu)鑒定,HPLC面積歸一化法測得含量為99.61%);山核桃外蒲殼于2008年采自安徽寧國,經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室劉守金教授鑒定為胡桃科山核桃屬植物山核桃(CaryacathayensisSarg.)的外蒲殼。2方法和結(jié)果2.1流動相、柱溫度和檢測波長色譜柱:Shim-packC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液水(79∶21);流速:0.8mL·min-1;柱溫:25℃;檢測波長:286nm;進樣量:20μL。2.2溶液制備2.2.1制備續(xù)濾液取山核桃外蒲殼粗粉約1.0g,精密稱定,置于100mL燒瓶中,精密加入甲醇50mL,浸泡1h后,回流提取2h,冷卻至室溫,用甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.2.2對照品儲備液的制備精密稱取球松素、大黃酚的對照品適量,分別用甲醇溶解并稀釋成含有20.6μg·mL-1球松素、67.0μg·mL-1大黃酚的單一成分對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量,用甲醇稀釋成含8.24μg·mL-1球松素、4.02μg·mL-1大黃酚的混合溶液,即得。2.3保留時間的確定在上述色譜條件下,分別取對照品溶液、供試品溶液各20μL進樣。結(jié)果從色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形良好,保留時間適中,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)為10000,球松素、大黃酚保留時間分別為14.5min、32.5min左右,色譜圖見圖1。2.4黃酚對混合對照品溶液的穩(wěn)定性精密吸取“2.2.2”項下的球松素、大黃酚的對照品儲備液適量,用甲醇配制成球松素濃度分別為4.12,8.24,16.48,20.60,25.75μg·mL-1,大黃酚濃度分別為1.005,2.010,4.020,8.375,13.40μg·mL-1的混合對照品溶液,分別進樣20μL,記錄色譜圖。以對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得到球松素、大黃酚回歸方程分別為:Y=9.76×104X+1.05×103r=0.9999Y=4.75×104X+1.78×104r=0.9998結(jié)果表明:球松素、大黃酚濃度分別在4.12～25.7μg·mL-1、1.01～13.4μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積值均呈良好線性關(guān)系。2.5儀器精密度試驗精密吸取上述“2.2.2”項下的對照品溶液20μL,分別連續(xù)進樣6次,測定球松素、大黃酚峰面積,其RSD分別為0.36%和0.37%,表明儀器精密度良好。2.6供試品溶液穩(wěn)定性取供試品溶液,分別于0,4,8,12,24h進樣20μL,測定球松素、大黃酚峰面積,其RSD分別為1.5%和0.77%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7樣品含量測定取山核桃外蒲殼粗粉,按“2.2.1”項下方法制備6份供試品溶液,進樣20μL,測定樣品含量。結(jié)果樣品中球松素、大黃酚平均含量分別為0.0853%和0.0178%,RSD分別為1.3%和0.83%,表明本測定方法重復(fù)性良好。2.8加樣回收率試驗精密稱取已知含量的山核桃外蒲殼粗粉約0.5g,共6份,分別精密加入“2.2.2”項下的對照品儲備液各1mL,按“2.2.1”項下方法制備供試溶液,進樣20μL,計算加樣回收率平均值(n=6)分別為97.8%和98.0%,RSD分別為1.1%和1.7%。2.9樣品含量的測量取3批樣品,按“2.2.1”項下方法制得供試品溶液,進樣測定,用外標兩點法計算得球松素、大黃酚平均含量,結(jié)果見表1。3流動相的選擇本研究過程中對提取方法、提取溶劑及用量和提取時間等實驗條件進行了考察。結(jié)果表明,以甲醇回流提取最佳,用50mL甲醇回流提取2h已能將有效成分基本提取完全。分別對球松素和大黃酚對照品溶液進行了紫外掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們有共同的最大吸收峰286nm,故選擇286nm為檢測波長。對流動相甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)、甲醇-0.1%磷酸溶液(79∶21)、甲醇-0.1%磷酸溶液(74∶26)進行考察。