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綠球藻choroccumspmc-1株系高鹽堿培養(yǎng)適應(yīng)性及蝦青素積累特性的初步研究
蝦青素屬于氨基酸丙烯酸酯。它是許多水生動物所需的營養(yǎng)成分和優(yōu)良的顏色組合。它具有抗紫外輻射、抗癌、腫瘤等功能。蝦青素抗氧化功能遠遠高于其它次生類胡蘿卜素、維生素E和維生素C,因而倍受食品、制藥和化妝品工業(yè)的青睞。近年來,從微藻中開發(fā)高值化的天然蝦青素在國際上引起了廣泛的關(guān)注。雨生紅球藻Haematococcuspluvialis在脅迫條件下可以大量積累蝦青素,含量高達細胞干重的4%,遠遠高于其它生物。由于雨生紅球藻生長速度慢,易受微生物污染,在培養(yǎng)過程中難以獲得高產(chǎn),使其產(chǎn)品成本高昂,嚴重妨礙了產(chǎn)業(yè)開發(fā)與推廣。由此尋找可快速生長、積累蝦青素的綠藻如小球藻Chlorellazofingiensis、綠球藻Chlorococcumsp.等綠藻作為替代種源受到廣泛重視。迄今為止,在世界上數(shù)萬種微藻資源中,產(chǎn)業(yè)開發(fā)最為成功的僅有螺旋藻、小球藻和鹽藻,藻種對高堿和(或)高鹽的極端適應(yīng)和快速生長特性對其產(chǎn)業(yè)開發(fā)起到關(guān)鍵作用。篩選極端適應(yīng)和快速生長的微藻,建立低成本開放式養(yǎng)殖,提高細胞生物活性成分的含量,研究極端條件下生物活性物質(zhì)的誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)化機制具有重要的理論與實踐意義。本研究對分離篩選到的耐堿性綠球藻開展生長特性、極端適應(yīng)特性和蝦青素誘導(dǎo)等方面進行的初步研究,探索合理開發(fā)天然蝦青素的新方法與新思路,為其產(chǎn)業(yè)開發(fā)與深入研究打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1藻類和繁殖方法1.1.1微藻體系的分離與純化本研究材料綠球藻株系MC-1(簡稱MC-1)由中國科學(xué)院南海海洋研究所微藻項目組于2002年在室外藍藻培養(yǎng)箱中分離得到,后經(jīng)固體純化培養(yǎng)得到株系。1.1.2檸檬酸和土壤提取液使用ZSNT培養(yǎng)基,配制方法為每升蒸餾水中分別加入1gNaCl、0.05gNaH2PO4·2H2O、1gNaNO3、0.02gCaCl2、0.05gMgSO4·7H2O、0.01g檸檬酸以及M2、A5和土壤提取液各1ml,其中每升M2水溶液含有0.244gFeCl3·6H2O和0.189gNa2EDTA,每升A5水溶液含有2.86gH3BO3、0.22gZnSO4·7H2O、0.01gMOO3、1.80gMnCl2·4H2O和0.08gCuSO4·5H2O。ZSNT培養(yǎng)基pH為7.91,高壓滅菌后根據(jù)實驗設(shè)計的需要添加不同量的NaHCO3。1.1.3體外強光誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)紅耐堿性實驗在培養(yǎng)室內(nèi)進行,培養(yǎng)架光強為135μE·m-2·s-1,溫度為28±2℃,光周期L∶D為24∶0。室外強光誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)紅:將室內(nèi)培養(yǎng)綠色細胞分2組轉(zhuǎn)移到室外培養(yǎng),其中1組維持室內(nèi)培養(yǎng)時的營養(yǎng)鹽條件,NaCl和NaHCO3濃度同為1g·L-1,另一組采用高鹽高堿誘導(dǎo),通過逐步加入NaCl和NaHCO3,使其終濃度分別為51g·L-1和81g·L-1,總鹽度大于130,太陽直射光最大光強約1400μE·m-2·s-1。1.1.4mc-1生長曲線的繪制MC-1生長測定用Unicon-UV-2102紫外可見光分光光度計測波長700nm光密度值作為生物量指標,繪制MC-1的生長曲線并計算比生長率。1.2hplc分析HPLC方法參考Yuan等的方法進行,藻細胞經(jīng)離心收集,棄上清液,用蒸餾水清洗,然后冷凍干燥。定量取冷凍干燥樣品10—15mg,在避光條件下加液氮研磨,丙酮反復(fù)提取直至樣品變白為止。提取液低溫高速離心(4℃,12000r·min-1離心20min)去沉淀,上清液用氮氣吹干,用甲醇/二氯甲烷(9.5∶3)定容為1.25ml,然后進行HPLC分析。儀器采用美國Waters1525型高效液相色譜儀,Waters2996型檢測器,Waters反相色譜柱SymmetryShieldTMRP185μm(3.9mm×150mm)。HPLC流動相A液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水為10∶170∶11∶9;B液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水為44∶56∶91∶9。用100%的A液梯度洗脫0—8min;用0到100%的B液梯度洗脫8—15min;用0到100%的A液梯度洗脫15—16min;用100%的A液梯度洗脫16—25min。流速為1.0ml·min-1,進樣體積20μl。2996型檢測器在250—700nm波長范圍掃描,在450nm處進行檢測。用蝦青素、葉黃素、角黃素、葉綠素b、葉綠素a和β-胡蘿卜素(Sigma產(chǎn)品)做標準品。類胡蘿卜素含量測定參考Dere等的方法進行。1.3t檢驗的應(yīng)用實驗設(shè)2個平行樣,取其平均值。統(tǒng)計用Excel將實驗組和對照組進行顯著性t檢驗,以p<0.05作為顯著依據(jù)。圖1、2中所示值為平均值±標準差。2結(jié)果2.1比生長率及比生長率在較低碳酸氫鈉濃度范圍內(nèi),MC-1具有良好的快速生長特性,其中碳酸氫鈉濃度為0.8g·L-1時,最大比生長率達到每天1.18,分裂代時為14h,持續(xù)培養(yǎng)1周,平均比生長率最高每天可達0.49,平均分裂代時為34h(圖1)。碳酸氫鈉在較低濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加促進MC-1生長作用越明顯,完全不加碳酸氫鈉組的生長率低于不同濃度的添加組(圖1,2)。2.2生長狀態(tài)對mc-1的影響圖2顯示MC-1在高堿條件下的快速生長特性,在含有8—20g·L-1碳酸氫鈉的高堿培養(yǎng)基中,MC-1生長狀態(tài)良好,無論是最大生長率還是平均生長率均保持較高的水平。經(jīng)測定,在3—4d內(nèi)的進一步培養(yǎng)中,MC-1培養(yǎng)物的pH從8左右迅速升到12以上,并繼續(xù)生長,表現(xiàn)出非同尋常的極端堿性適應(yīng)特性。2.3紅色細胞色素組分的hplc分析室內(nèi)培養(yǎng),處于靜止生長的老化培養(yǎng)物,藻細胞逐漸轉(zhuǎn)紅,而經(jīng)室外強光照射,指數(shù)生長狀態(tài)的藻細胞也迅速轉(zhuǎn)紅(轉(zhuǎn)紅周期見表2)。圖3、4為綠色和紅色細胞色素組分的HPLC分析結(jié)果,并通過標準樣、保留時間和特征吸收峰以及參考文獻鑒別色素組分(表1)。HPLC結(jié)果表明,綠色細胞轉(zhuǎn)為紅色細胞后,其光合色素組分發(fā)生改變,出現(xiàn)了蝦青素、蝦青素酯、金盞花黃質(zhì)以及金盞花黃質(zhì)酯4個新組分。由圖4各組分的光吸收強度可以推斷,這4種次生類胡蘿卜素組分占總色素含量的比例較大。同時,室內(nèi)緩慢和室外快速2種狀態(tài)的轉(zhuǎn)紅細胞,其光合色素組分基本一致。2.4蝦青素快速積累MC-1在室外強光低鹽低堿和強光高鹽高堿誘導(dǎo)下,細胞可分別在6、10d(其中有2個陰天)的短時間內(nèi)轉(zhuǎn)紅,并快速積累蝦青素(表2)。室內(nèi)培養(yǎng)MC-1轉(zhuǎn)紅細胞,蝦青素含量是0.61mg·g-1,總類胡蘿卜素含量是1.25mg·g-1,強光誘導(dǎo)后蝦青素和總類胡蘿卜素含量稍有提高,強光高鹽高堿誘導(dǎo)后兩者含量顯著提高(p<0.05),分別提高50.46%和71.20%,含量達到0.93mg·g-1和2.14mg·g-1。3討論3.1ph對微藻細胞生長的影響MC-1具有良好的極端堿性、滲透脅迫(高鹽)適應(yīng)特性。堿性的大幅度變動對MC-1的生長影響不明顯(圖2),最大適應(yīng)生長pH大于12,并可以忍耐130以上的高鹽度,并能使細胞快速轉(zhuǎn)紅。這種生理特性在微藻中十分罕見。利用這一特性,可望建立如同鹽藻和螺旋藻模式的開放培養(yǎng)系統(tǒng),通過碳酸氫鈉濃度和鹽度來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物狀態(tài),避免其它生物污染,實現(xiàn)低成本的大規(guī)模培養(yǎng)。3.2mc-1核心呈味生物,其缺失代謝,其細胞毒性影響尋找快速生長、極端適應(yīng)和積累蝦青素的藻類來取代雨生紅球藻的研究引起了科研工作者的廣泛重視。Ip報道了快速生長的小球藻可以混合培養(yǎng)并可積累大量的蝦青素。Zhang等報道了一種快速生長、適應(yīng)高pH、強光誘導(dǎo)產(chǎn)生大量蝦青素的綠球藻,其可適應(yīng)的最大pH只在10.0以下,pH高于10.0的培養(yǎng)條件將導(dǎo)致細胞很快死亡。但本實驗中MC-1在室外高鹽高堿條件下可高效積累蝦青素等次生類胡蘿卜素,其轉(zhuǎn)化速度明顯快于已報道的其它綠藻,并能維持高比例的游離蝦青素(占總類胡蘿卜素的43%),顯示出獨特的應(yīng)用價值與理論研究意義。MC-1次生類胡蘿卜素代謝特別是蝦青素的誘導(dǎo)合成過程較為特殊,其它綠藻出現(xiàn)多種蝦青素中間代謝產(chǎn)物,如海膽酮、3-羥基海膽酮、β-隱黃質(zhì)、Adonirubin、金盞花黃質(zhì)等,而MC
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