野生和栽培番茄耐鹽ql定位與轉(zhuǎn)育研究

野生和栽培番茄耐鹽ql定位與轉(zhuǎn)育研究

近年來，由于品種增加，次生含鹽量問題日益突出。鹽害能限制番茄(Solanumlycopersicum)的生長、發(fā)育,引發(fā)臍腐病,最終導致產(chǎn)量下降。因此,培育耐鹽番茄新品種具有重大意義。研究表明,野生番茄資源中醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)、秘魯番茄(Solanumperuvianum)、契斯曼尼番茄(Solanumcheesmanii)、多毛番茄(Solanumhabrochaites)、潘那利番茄(Solanumpennellii)等含有大量的耐鹽基因(Foolad&Lin,1997),發(fā)掘野生番茄資源中的耐鹽基因并將其轉(zhuǎn)育至栽培品種,是解決番茄品種耐鹽問題的重要途徑。Foolad在定位番茄耐鹽QTL方面做了大量的工作,1998年利用醋栗番茄LA722和栽培番茄的BC1群體,構建了包含151個RFLP標記的分子遺傳連鎖圖譜,將7個番茄芽期耐鹽QTL定位在1、2、5、7、9、12號染色體上,其中6個QTL源于LA722,分布在1、2、5、9、12號染色體,共解釋了總遺傳變異的67.1%(Fooladetal.,1998)。Foolad的研究均以F2、BC1等群體進行QTL定位,獲得的材料含有野生番茄的不良性狀較多,其含有的外源野生番茄的DNA片段比較長,QTL與產(chǎn)量低、果實小、品質(zhì)低劣等不良農(nóng)藝性狀之間的連鎖累贅較大,難以直接應用于育種實踐。因此,Tanksley和Nelson(1996)提出了高代回交QTL分析法(Advancedbackcrossquantitativetraitlocusanalysis,AB-QTL),其主要步驟是將普通栽培番茄與野生番茄雜交后,連續(xù)進行2至3次回交以滲入輪回親本的85%～95%的遺傳信息,再利用BC2和BC3群體進行QTL分析。該方法不僅能完成QTL的定位,還能減少連鎖累贅的影響,在完成QTL定位后的1～2年即可得到可直接用于生產(chǎn)的優(yōu)異新品系。AB-QTL分析法已廣泛應用于水稻、小麥、大麥、棉花、番茄等作物野生資源有利基因的發(fā)掘中(Fultonetal.,2002;李德軍等,2002;Fraryetal.,2004;Korffetal.,2005;李愛國等,2008;Nazetal.,2008)。但是利用AB-QTL方法進行QTL定位和耐鹽種質(zhì)創(chuàng)制存在問題是,進行QTL分析的群體往往較小,導致以栽培番茄優(yōu)良親本為遺傳背景含野生番茄的耐鹽基因的單株出現(xiàn)的概率較低,特別是包含所有野生番茄的耐鹽基因的優(yōu)異單株出現(xiàn)的概率更低。另外,對大規(guī)模群體的植株進行耐鹽性鑒定缺少行之有效的鑒定方法,進行耐鹽鑒定所需的時間長,成本高,誤差大。這些原因致使耐鹽QTL的全面定位未能完成,一些作用較小的QTL可能未被檢測出來,至今未克隆到相應的耐鹽QTL,含有野生番茄耐鹽QTL,特別是同時含有多個主效耐鹽QTL的育種種質(zhì)尚未育成。為解決上述問題,本研究利用野生醋栗番茄LA722與栽培番茄優(yōu)良骨干親本9706為材料,結合AB-QTL分析法和發(fā)芽期大規(guī)模鹽脅迫篩選法,對野生醋栗番茄LA722中的耐鹽QTL進行定位,并盡可能地將耐鹽QTL轉(zhuǎn)移至栽培番茄骨干系中。1材料和方法1.1不同菌株對bc1和bc3的生長和復育的種子和貯藏試材為鹽敏感栽培番茄9706和耐鹽醋栗番茄LA722。9706是中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所鮮食番茄組選育的栽培番茄優(yōu)良骨干親本,具有產(chǎn)量高,抗病毒病、葉霉病和枯萎病等優(yōu)點;野生醋栗番茄LA722具有高產(chǎn)、高耐鹽性和抗病性等多種優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。本研究于2005—2009年進行。2005年春季于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉所溫室種植番茄9706和醋栗番茄LA722,進行雜交獲得F1代種子。2005年秋季以栽培番茄9706為輪回親本與F1代植株回交,獲得BC1代種子;2006年春季將大約200000粒BC1代種子均勻地鋪在底部鏤空的塑料容器中(規(guī)格為65cm×38cm×22cm,底部鋪兩層棉紗),浸沒在0.15mol·L-1NaCl+0.015mol·L-1CaCl2的鹽水中,室溫條件下發(fā)芽,每日換一次鹽水。經(jīng)過鹽脅迫篩選,選出最早發(fā)芽的前100粒播種于溫室內(nèi)。100棵植株與栽培番茄9706回交獲得BC2代種子;2008年2月大約200000粒BC2代種子經(jīng)過鹽脅迫篩選,選出最早發(fā)芽的前100粒種子播種于溫室內(nèi),與9706回交獲得100棵BC3代植株,按發(fā)芽時間的早晚排序,編號為1～100。BC3植株自交,每株上收獲自交種子。2008年8月從1～40號單株中,隨機挑選7粒播種于田間,得到280個BC3S1單株作為作圖群體,單株自交后獲得的280份BC3S2種子用作芽期耐鹽的表型鑒定。1.2種子發(fā)芽試驗參照Foolad(1998)方法,將280份單株的BC3S2種子在室溫0.15mol·L-1NaCl+0.015mol·L-1CaCl2的鹽脅迫條件下進行種子發(fā)芽試驗,每單株50粒,設置3次重復,放置于墊有濾紙的口徑為7cm的培養(yǎng)皿中,記錄每日發(fā)芽數(shù),共觀察記錄28d,計算發(fā)芽20、24和28d的發(fā)芽指數(shù)(Germinationindex,GI),分別記為GI20、GI24、GI28。GI=(∑TiNi)/S,Ti為從浸種到發(fā)芽所需的天數(shù),Ni為第i天發(fā)芽的種子數(shù),S為全部發(fā)芽的種子數(shù)。GI值越小,發(fā)芽速率就越快。1.3ssr-pcr法測定dna片段聚丙烯酰胺凝膠電泳待植株長到三葉一心時,取剛展開的嫩綠葉片,采用CTAB法提取DNA,用分光光度計測定DNA濃度。Li&Quiros,2001)引物序列由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所生物技術室王曉武老師惠贈,由上海生工生物工程技術有限公司合成。CAPS分析:25μL的PCR反應體系中含有10×buffer2.5μL,2.5mmol·L-1dNTP2.0μL,引物30ng,TaqE1U,模板DNA50ng。dNTP和TaqE均購自天根生化科技有限公司。反應程序為94℃預變性3min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃終止反應。取10μL反應產(chǎn)物,與2μL溴酚藍(0.25%溴酚藍,40%蔗糖水溶液)混勻,點入含0.5mg·L-1EB的2%瓊脂糖凝膠中,在5V·cm-1電場強度下電泳1～2h,以100bpDNAMarker作為標準分子量標記,確定DNA片段在膠上的相對位置,利用凝膠分析儀進行凝膠分析。SSR分析:20μL的PCR反應體系中含10×buffer2.0μL,dNTP1.6μL,引物30ng,TaqE1U,模板DNA10ng。反應程序為94℃預變性3min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1.5min,35個循環(huán);72℃延伸7min,4℃終止反應。取SSR擴增樣品與上樣緩沖液(98%甲酰胺,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯青)各5μL混合,95℃變性8min,立即置于冰上冷卻。每個樣品取4.5μL上樣,用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳,70W恒功率電泳約50min,終止電泳。最后進行銀染顯色。SRAP分析:20μL的PCR反應體系中含10×buffer2.0μL,dNTP1.6μL,引物30ng,TaqE1U,模板DNA10ng。反應程序為94℃預變性3min;94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5個循環(huán);94℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃保溫10min,4℃終止反應。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色。CAPS和SSR標記的統(tǒng)計方法:來自父本的純合帶型記為“a”,來自母本的純合帶型記為“b”,雜合帶型記為“h”,模糊不清或者丟失的帶記為“u”。SRAP標記的統(tǒng)計方法:“a”為來自父本帶型,“b”為來自母本帶型,“c”為非“a”,“d”為非“b”。采用JoinMap4.0分析數(shù)據(jù),將LOD值的范圍設定為“4”到“10”之間,構建遺傳連鎖圖譜。1.4qtl的分析采用SSPS11.5對BC3S2種子的平均發(fā)芽指數(shù)分布頻率進行分析,確定是否適于數(shù)量性狀的分析。利用MapQTL4.0軟件,采用多QTL(Multi-QTLMapping,MQM)分析法檢測QTL的位置和效應。首先運用區(qū)間分析法初步檢測QTL。然后通過“PermutationTest”計算,確定在整個基因組中QTL存在的LOD閾值。最后利用MQM分析法,選擇余因子“cofactor”檢測QTL的位置與效應。將GI20、GI24、GI28性狀指標分別做QTL分析,確定最優(yōu)的QTL定位的性狀指標。1.5極耐鹽質(zhì)量分數(shù)的測定在果實成熟期對280株BC3S1植株所結果實的單果質(zhì)量、可溶性固形物含量和單株產(chǎn)量進行調(diào)查。在每株植株第2、3果穗上選取10個生長正常、成熟期一致的果實,稱其質(zhì)量,取平均值,測定每個果實的可溶性固形物含量,取平均值;對單株上所有果實分批稱其質(zhì)量,最后計算單株總產(chǎn)量。對280份BC3S2自交種子的發(fā)芽指數(shù)和對照栽培番茄9706的發(fā)芽指數(shù)進行方差分析,篩選出極耐鹽單株(發(fā)芽指數(shù)越小,說明種子越耐鹽)。根據(jù)QTL定位的結果,對主效應QTL區(qū)域的標記和極耐鹽單株作基因型分析,選出在表型和QTL分析中均表現(xiàn)耐鹽性的單株作為育種材料。2結果與分析2.1多態(tài)性ssr標記的篩選從Tanksley的遺傳圖譜(Tomato-EXPEN2000)中選出415個CAPS標記進行分析,篩選到56個可用于本研究的CAPS標記,同時將該圖譜上的55個RFLP標記中的18個成功轉(zhuǎn)化成CAPS標記,共獲得74個多態(tài)性CAPS標記;從392對SSR引物中篩選出70個多態(tài)性SSR標記。利用55對SRAP引物組合篩選出可以穩(wěn)定擴增的SRAP引物28對,選取其中的8對引物對群體進行遺傳分析,共產(chǎn)生39個標記位點。各染色體上多態(tài)性標記數(shù)見表1。2.2ssr和srap標記的a分析利用篩選得到的74個CAPS、70個SSR和39個SRAP標記對群體DNA進行遺傳分析(圖1,圖2,圖3),采用JionMap4.0對標記數(shù)據(jù)進行連鎖分析,構建了包含26個CAPS、66個SSR和20個SRAP標記的遺傳連鎖圖譜,共覆蓋基因組總長度773.5cM,平均圖距為7.97cM。2.3產(chǎn)鹽期耐鹽srl的定位2.3.1c3s2群體合同多態(tài)性采用SPSS11.5軟件對LA722、9706和BC3S2群體GI進行頻率分布分析(圖4),結果表明鹽脅迫條件下群體發(fā)芽速度分離明顯,BC3S1群體的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)的正態(tài)分布,是一個典型的數(shù)量性狀。2.3.2含ga2的種子質(zhì)量以LOD>2.0為QTL檢出的閾值,對GI20、GI24和GI28指標分別作QTL分析,共檢測到7個、11個和6個與耐鹽相關的QTL位點。以GI20和GI28指標檢測出的QTL數(shù)量較少,主要原因是20d前有些株系未發(fā)芽,而24d后陸續(xù)有部分株系的種子發(fā)霉,GI指數(shù)受到了影響產(chǎn)生了偏差,導致某些QTL未檢測出來。因此,本研究確定以發(fā)芽24d時的發(fā)芽指數(shù)GI24作為檢測QTL存在的性狀指標。利用GI24指標檢測到的11個QTL中的8個來自醋栗番茄LA722,分別為qST-2-1、qST-2-2、qST-3-1、qST-5-2、qST-8-1、qST-9-1、qST-9-2、qST-12-1,位于2、3、5、8、9、12號染色體上,貢獻率分別為5.4%、13.6%、4.6%、2.7%、7.8%、3.5%、10.2%、9.3%,解釋了總遺傳變異率的57.1%;3個來自栽培番茄9706,分別為qST-1-1、qST-5-3、qST-5-1,位于1號和5號染色體上,貢獻率分別為8.3%、3.3%、4.5%(表2),共解釋了總表型變異的16.1%。2.4極耐鹽株系的農(nóng)藝性狀280份BC3S2自交種子的發(fā)芽指數(shù)GI在10.6～23.6之間,平均為19.2。經(jīng)方差分析后確定,BC3S2自交種子當GI<18.396時,極顯著小于對照9706。共有58個株系的GI<18.396,為芽期極耐鹽株系,其BC3S1代單果質(zhì)量、單株產(chǎn)量、固形物含量等農(nóng)藝性狀均接近于栽培番茄9706(表3),可作為芽期耐鹽的育種材料。對部分耐鹽株系的2個主效QTLqST-8-1和qST-9-2含有與否情況進行分析(圖5),230-1和230-3株系含QTLqST-8-1,228-4株系含主效QTLqST-9-2,231-6,210-7,226-1,226-6、226-7和204-7株系同時含有2個主效QTL。3耐鹽的sst-ssr分析AB-QTL分析法具有將QTL分析與育種選擇相結合的特點,但是AB-QTL分析需要培育較大的群體,這無疑大大增加了QTL定位的工作量,在分析過程中,因種植群體有限,很容易丟失含有目的基因的單株,特別是同時含有供體親本所有有益基因的單株。針對這個問題,黎志康(2005)提出將目標性狀的表型選擇與AB-QTL相結合,通過分子標記跟蹤供體基因的流向,獲得定向選擇所導致的等位基因頻率變化信息,進而定位目標性狀QTL。利用攜帶有利等位基因的高代回交導入系進一步進行QTL有利等位基因聚合,培育目標性狀獲得顯著改良的新品種。本研究在各個回交世代進行大規(guī)模鹽脅迫篩選,既保證了耐鹽基因較少流失,又使獲得的耐鹽材料的農(nóng)藝性狀更接近栽培番茄,通過此方法已經(jīng)篩選得到了一些耐鹽材料,并且農(nóng)藝性狀接近栽培番茄9706,例如耐鹽株系230-1、230-3、231-6、210-7、226-1、226-6、226-7、204-7、228-4等。該結果表明進行大規(guī)模鹽脅迫篩選方法是有效的,它可以將野生番茄的耐鹽QTL轉(zhuǎn)移至栽培番茄中,其中一些株系含有所有野生番茄的有益QTL。從圖5中可以看出231-6株系中qST-8-1和qST-9-2存在加性效應,但從表3中的GI24來看,qST-8-1和qST-9-2并不存在加性效應,這可能是因為只利用這兩個QTL分析是不全面的,發(fā)芽指數(shù)還受到其他QTL的影響。本研究構建的番茄遺傳連鎖圖譜覆蓋基因組773.5cM,與已發(fā)表的分子遺傳連鎖圖譜具有較好的一致性(Fraryetal.,2005;劉楊等,2005普通栽培番茄一般表現(xiàn)對鹽中度敏感,番茄耐鹽性受QTL控制,遺傳較為復雜(李君明等,2006)。Foolad(2004)的研究結果表明,番茄耐鹽受生長發(fā)育特異階段多基因控制,而且環(huán)境影響較大。在發(fā)育的各個階段都對鹽比較敏感,而發(fā)芽期和幼苗期最敏感,且受環(huán)境影響較小。影響芽期和幼苗期的耐鹽性為少數(shù)主效QTL和幾個微效QTL控制,且主效QTL效應較大。因此開發(fā)芽期和幼苗期耐鹽QTL對于番茄耐鹽育種意義較大。在表型鑒定上,不僅要求發(fā)芽期具有耐鹽性,還要求生長發(fā)育的各個階段均具有耐鹽性。由于本試驗獲得的是發(fā)芽期耐鹽的材料,還需要進一步驗證其全生育期的耐鹽性。QTL定位的結果與Foolad等(1998)將芽期耐鹽QTL定位在1、2、5、7、9、12號染色體上的結果有些不同,可能是不同栽培材料或不同群體間的差異所致。本研究中