鋅對球等鞭金藻生長及相關生化成分含量的影響

鋅對球等鞭金藻生長及相關生化成分含量的影響

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬對水環(huán)境的危害日益嚴重。鋅是海洋中含量最高的重金屬元素之一,據(jù)國家環(huán)?？偩止嫉臄?shù)據(jù),渤海灣底泥中鋅的含量超標2000多倍,海水中的鋅也常超出四類水質(zhì)要求。Zn是藻類生長代謝必需的微量元素,在保持蛋白核的完整中起著重要作用。但高濃度的Zn能抑制光合作用,降低葉綠素含量,使類胡蘿卜素和葉綠素的比例失調(diào);Zn也會導致細胞膜通透性增加,使電解質(zhì)漏失,引起細胞形態(tài)變異。無論從環(huán)境的角度還是藻類自身的生長來看,研究鋅對藻類的影響至關重要。等鞭金藻是一種單細胞微藻,體形小、繁殖快、胞內(nèi)營養(yǎng)豐富,細胞壁薄,容易被水生動物幼體消化吸收,是海產(chǎn)經(jīng)濟動物幼蟲良好的基礎餌料。目前有關球等鞭金藻的研究多集中在營養(yǎng)鹽、pH值、溫度等環(huán)境因子的影響;有關重金屬對藻類的影響報道多數(shù)集中在小球藻、雨生紅球藻等。在重金屬的選擇中,大多數(shù)實驗選用了Cd2+,Cu2+,Pb2+,Cr6+等元素,同時有關藻類吸附重金屬的研究也多數(shù)集中于小球藻,有關球等鞭金藻吸附重金屬的研究較少。有研究表明藻類具有個體小、生長速度快、代謝迅速、吸附作用快、凈化效率高等特點,對重金屬有較強的富集和解吸能力,更適于低濃度重金屬離子廢水的處理。本實驗選用廢水中比較常見而又相對研究較少的Zn2+作為研究對像,考察Zn2+對球等鞭金藻生長及其生化成分的影響,以期為球等鞭金藻的培養(yǎng)及為含有較低濃度重金屬廢水的生物處理提供研究依據(jù)。1材料和方法1.1藻類藻類球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)原種系中國海洋大學提供,經(jīng)進一步分離后由煙臺大學海洋生化工程研究所保存。1.2水質(zhì)及密度測定實驗用海水取自煙臺附近無污染海水,經(jīng)沉淀、砂濾和0.45μm膜過濾處理,鹽度為32‰左右。海水中Zn2+濃度低于0.1μg/L,其他重金屬含量均符合GB3097-1997一類水質(zhì)標準。將純種接種于注入300mL海水的三角瓶中,接種量10%,使培養(yǎng)液中藻密度達到2×104cell/mL。23℃連續(xù)光照通氣培養(yǎng),光照強度35～40μmol/m2·s-1,藻體培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)基,培養(yǎng)初期向培養(yǎng)基中加入7個濃度梯度的Zn2+,對照組不加Zn2+。每個濃度設三個平行樣。1.3海水稀釋實驗實驗用ZnSO4·7H2O(分析純)為Zn2+來源,用蒸餾水配成10g/L的母液,用無菌海水稀釋至實驗所需濃度。根據(jù)國家海洋環(huán)境公告中黃渤海海域近海的污染情況,在預實驗的基礎上,設置7個Zn2+濃度梯度:0.1,0.5,1.0,4.0,10.0,20.0,30.0mg/L。1.4測量1.4.1藻的干重測定把藻液(2×106cell/mL)按一定比例稀釋5個濃度梯度,443nm測定其吸光度OD443,另取5mL藻液用微孔過濾器過濾,用蒸餾水反復洗滌藻泥,將濾膜放于60℃烘箱內(nèi)烘干,得濾膜前后的重量差即為藻的干重M。做出標準曲線,回歸分析得出方程:M=1.1091OD443-0.0023(R2=0.9985),由測得的OD443值,計算藻液的細胞干重(mg/L)。1.4.2znso4的測定取40mL藻液離心,棄去上清液。藻泥破碎凍融3次,加入PBS3mL,充分振蕩后,在3000r/min下離心10min,取1mL上清液加入0.1mL0.1mol/LZnSO4,沸水浴5min,立即加入10%亞鐵氰化鉀0.1mL,離心10min,取上清液1mL加入3mL蒽酮中,沸水浴10min,冷水浴迅速冷卻至室溫,穩(wěn)定后測定620nm波長處的吸光度。根據(jù)標準葡萄糖曲線可確定樣品中多糖的含量。1.4.3通過丙酮提取法測定了球和其他鞭金藻細胞的葉色1.4.4測波長的測定藻泥破碎凍融3次,加入PBS3mL,充分振蕩后,在3000r/min下離心10min,取1mL上清液加入3mL考馬司亮藍溶液,測定595nm波長處的吸光度。根據(jù)標準蛋白質(zhì)曲線可確定樣品中蛋白質(zhì)的含量。2結果與討論2.1z2+對藻液生物量的影響圖1顯示了不同濃度的Zn2+對球等鞭金藻生長的影響。結果表明,低于4.0mg/L的Zn2+對球等鞭金藻的生長沒有明顯的抑制作用,在此濃度范圍內(nèi),球等鞭金藻能很快地適應Zn2+的環(huán)境,到對數(shù)生長期時藻液生物量已經(jīng)與對照組沒有顯著差異;當球等鞭金藻處于高濃度的Zn2+中時,它的適應期明顯延長,并且整個生長過程不出現(xiàn)對數(shù)生長期,限制了藻密度的提高,最終的生物量僅為空白組的38.1%;當金屬Zn2+濃度達到20mg/L時,對球等鞭金藻產(chǎn)生了明顯的抑制作用,球等鞭金藻在生長后期出現(xiàn)了死亡,藻液生物量下降。文獻表明,高濃度的Zn2+抑制了藻類的光合作用,造成類胡蘿卜素與葉綠素的比例失調(diào),從而引起藻類死亡。由此可見,球等鞭金藻對低于4.0mg/L的Zn2+有一定的耐受性。2.2z2+對球等鞭金藻多糖含量的影響圖2～圖4表示了不同濃度Zn2+對單位體積培養(yǎng)液中球等鞭金藻各種生化成分(蛋白質(zhì)、多糖和葉綠素)含量的影響。圖2顯示,單位體積培養(yǎng)液中球等鞭金藻蛋白質(zhì)含量均隨培養(yǎng)時間的增加而升高,培養(yǎng)后期蛋白質(zhì)含量有所下降。Zn2+濃度低于4.0mg/L時,實驗組和對照組的蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異。在10.0mg/LZn2+溶液中培養(yǎng)至第4天單位體積培養(yǎng)液中球等鞭金藻的蛋白質(zhì)含量高于對照組22.4%,是各組中最高的;但隨著Zn2+作用時間的增長,蛋白質(zhì)含量降低,6d后低于對照組。20.0mg/L,30.0mg/L的Zn2+培養(yǎng)液中球等鞭金藻蛋白質(zhì)的含量明顯低于對照組。圖3顯示,Zn2+影響球等鞭金藻的光合作用,使葉綠素含量降低。隨著Zn2+濃度的升高,這種影響越來越明顯,且在藻類生長的初期抑制作用更為明顯。在第2天,0.1,0.5,1.0,4.0mg/L的Zn2+藻液的葉綠素含量約為對照組的1/2,差異明顯;隨著球等鞭金藻對Zn2+的適應,藻中葉綠素含量有所升高,其中0.1～1.0mg/L濃度下單位體積藻液中葉綠素含量與空白組較接近,各組之間無顯著差異。4.0mg/L的Zn2+藻液中葉綠素含量低于對照組,且差異顯著。在10.0mg/LZn2+的培養(yǎng)液中,隨著時間的增長葉綠素的含量基本上沒有變化,藻液中加入20.0和30.0mg/LZn2+后,球等鞭金藻的葉綠素含量降到最低點,6d后20.0mg/LZn2+的藻液中葉綠素含量有所回升,而30.0mg/LZn2+的藻液中葉綠素仍保持很低的量。圖4顯示:0.1～20.0mg/LZn2+濃度培養(yǎng)時,單位體積培養(yǎng)液中球等鞭金藻中多糖含量隨時間增加而升高,8d后趨于平穩(wěn)或略有下降。其中0.1～4.0mg/LZn2+濃度下,多糖含量與對照組接近,無顯著差異;當Zn2+濃度超過10mg/L時多糖含量明顯低于對照組;30.0mg/L的Zn2+濃度下整個培養(yǎng)過程中多糖含量維持在一較低水平,變化不大。2.3z2+培養(yǎng)液中藻細胞多糖含量的變化由于不同濃度的Zn2+培養(yǎng)液中球等鞭金藻的生物量發(fā)生了明顯變化,為進一步研究不同濃度的Zn2+對球等鞭金藻細胞中生化成分的影響,本實驗選取第8天的藻液測定其生物量和生化成分,所得結果見圖5。圖5顯示,培養(yǎng)8d后,在0.1～4.0mg/LZn2+培養(yǎng)液中的藻細胞干重與對照組無顯著差異,當Zn2+濃度高于10.0mg/L時,藻細胞干重明顯降低。藻細胞中多糖含量的變化趨勢與藻的生長情況一致,隨著藻細胞密度的降低,藻細胞內(nèi)多糖含量也隨之降低。在0.1～4.0mg/L的Zn2+濃度范圍內(nèi),藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量基本不變,且與對照組接近;但當Zn2+濃度高于10.0mg/L時,藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量卻突然增加,這與單位體積培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的變化趨勢不同。藻細胞內(nèi)葉綠素含量的變化趨勢與藻細胞干重一致,與單位體積培養(yǎng)液中葉綠素的變化趨勢相似。2.4生物活性成分與其他生化成分的相互作用在本實驗中,球等鞭金藻對0.1～4mg/L的Zn2+有較強的適應性,在此濃度范圍內(nèi),藻的生長狀況對照組均無顯著差異,而當Zn2+濃度高于10.0mg/L時,藻的生長受到明顯抑制,培養(yǎng)液中的藻細胞密度明顯地與對照組。在微藻生長過程中,藻體自身合成一些生化物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、葉綠素等以維持自身的生長及細胞的正常狀態(tài)。在0.1～4mg/L范圍內(nèi),實驗組這幾種生化成分的含量與對照組無顯著差異,說明低濃度的Zn2+可以作為必需微量元素促進藻細胞生長、產(chǎn)糖及進行光合作用。之后隨著Zn2+濃度的升高,無論是單位體積培養(yǎng)液中,還是單位質(zhì)量藻細胞中的葉綠素和多糖含量均隨Zn2+濃度的升高而降低,說明高濃度的Zn2+影響球等鞭金藻的光合作用和生長,使葉綠素和多糖含量降低。而作為生命物質(zhì)的蛋白質(zhì),當微藻生長受到抑制,培養(yǎng)液中藻細胞干重降低時,單位質(zhì)量藻細胞中的蛋白質(zhì)含量反而有較大幅度增加,這可能是由于藻類自身的防御作用促使藻體本身蛋白質(zhì)含量增加;而且在這些生化成分中,蛋白質(zhì)的變化是最后最慢的,具有一定的滯后性。另外,死亡藻細胞發(fā)生藻體自溶現(xiàn)象,細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進入培養(yǎng)液中,造成藻液離心困難,使測定結果偏高。球等鞭金藻對0～4.0mg/L的Zn2+有較強的適應性,在此濃度范圍內(nèi)金藻可正常生長;根據(jù)國家海洋環(huán)境公告,海水中的Zn2+濃度為0.02～5.0mg/L,與球等鞭金藻的