不同提取方法對丹參中丹參酮a和丹酚酸b含量測定的影響

不同提取方法對丹參中丹參酮a和丹酚酸b含量測定的影響

丹參是司庫隆科的一種使用活血化瘀的藥物。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品。其性微寒,味苦,無毒。有活血通經(jīng),涼血消腫,除煩清心之功效。臨床上廣泛用于治療心血管疾病、腎病、肝病等,丹參的活性成分可分為水溶性成分和脂溶性成分兩大類,脂溶性成分包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ等,水溶性成分包括丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、原兒茶醛等。其中丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性化合物的代表成分,丹酚酸B是其水溶性化合物的代表成分。本實驗采用加熱回流提取、超聲波提取和組織破碎提取3種方法提取丹參中丹參酮和丹參酚酸B,并采用HPLC法對二者進行了測定。結(jié)果表明不同的提取方法對丹參中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量測定的影響較大。本法準確、方便、靈敏,穩(wěn)定性好,可用于丹參及其產(chǎn)品的質(zhì)量評價;組織破碎法提取效率明顯優(yōu)于加熱回流和超聲波2種提取法,而且大幅度地節(jié)能節(jié)時節(jié)約溶劑,為對其進一步的研究和推廣應(yīng)用提供了科學依據(jù)。1藥品、化學品和生物測量HPLC系統(tǒng):G1314AVWD紫外檢測器;G1311A四元泵;AgilentChemstation色譜工作站;BP211D分析天平(德國賽多利斯);KQ5200E超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);FW177中藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);PA6-GF30閃式提取器(北京金鼐科技發(fā)展有限公司);BXHW電熱套(北京科偉永興有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。對照品丹參酮ⅡA(批號110766-200416)及丹酚酸B(批號111562-200403)均購自中國藥品生物制品檢定所;丹參采自河南省方城縣,由鄭州大學劉若庸教授和潘成學副教授鑒定為唇形科鼠尾草植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖;甲醇為色譜純,水為超純水,95%乙醇、甲酸為分析純。2方法和結(jié)果2.1萃取溫度b采用YMCC18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,柱溫25℃;以甲醇(A)-0.5%甲酸水溶液(B)為流動相,進行梯度洗脫[0~30min,A-B(35∶65);30~35min,A-B(35∶65)→A-B(80∶20);35~50min,A-B(80∶20)],流速1.0mL·min-1;檢測波長:丹酚酸B為286nm(0~30min),丹參酮ⅡA為270nm(30~50min);進樣量20μL。2.2對照儲備液的制備精密稱取對照品丹參酮ⅡA5mg,置25mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得丹參酮ⅡA對照儲備液;精密稱取丹酚酸B5mg,置10mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得丹參酚酸B對照品儲備液。2.3試驗溶液的制備2.3.1浸膏的制備取干燥粉碎過6號篩的丹參粉末50g,精密稱定,置圓底燒瓶中,浸泡20min,加熱回流提取3次(電熱套加熱,溫度設(shè)定為65℃):每次精密加入75%乙醇400mL,提取時間分別為45,40,40min,靜置10min,過濾,合并3次濾液,濃縮,即得浸膏,精密稱定。精密稱取浸膏50mg,置50mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,以微孔濾膜(0.45μm)濾過,備用。同法制備3批樣品的供試品溶液。2.3.2單酯溶液配制取干燥粉碎過6號篩的丹參粉末50g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,浸泡20min,利用超聲波清洗機超聲波室溫提取3次:每次精密加入75%乙醇400mL,提取時間分別為30,25,20min,靜置10min,過濾,合并3次濾液,濃縮,即得浸膏,精密稱定。精密稱取浸膏50mg,置50mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,以微孔濾膜(0.45μm)濾過,備用。同法制備3批樣品的供試品溶液。2.3.3乙醇提取物的制備取丹參藥材50g精密稱定,浸泡20min,利用“閃式提取器”破碎室溫提取3次:每次分別精密加入75%乙醇350,300,300mL,提取時間分別為3,2,2min,靜置10min,過濾。合并3次濾液,濃縮,即得浸膏,精密稱定。精密稱取浸膏50mg,置50mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,以微孔濾膜(0.45μm)濾過,備用。同法制備3批樣品的供試品溶液。2.4線性關(guān)系2.4.1對照品溶液的制備精密量取丹參酮ⅡA對照品儲備液0.5,1.0,2.0,4.0,8.0mL,分別置于50mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得系列對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以丹參酮ⅡA的峰面積為縱坐標,進樣濃度(mg·mL-1)為橫坐標,計算回歸方程為:Y=121.3X+26.60r=0.9992丹參酮ⅡA濃度在0.002~0.032mg·mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。2.4.2對照品溶液的制備精密量取丹參酚酸B對照品儲備液0.15,0.3,0.6,1.2,2.4mL,分別置于5mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得系列對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以丹參酚酸B的峰面積為縱坐標,進樣濃度(mg·mL-1)為橫坐標,計算回歸方程為:Y=27.09X-218.4r=0.9997丹參酚酸B濃度在0.015~0.24mg·mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。2.5精密度測試取上述超聲波提取法制得的供試品溶液重復測定6次,測得丹參酮ⅡA峰面積的RSD為1.3%,丹參酚酸B峰面積的RSD為1.7%。2.6丹參酮與：總酚酸含量測定按照“2.3.1”,“2.3.2”,“2.3.3”項下方法,同一批藥材分別平行制備5份供試品溶液,進行測定。結(jié)果采用加熱回流提取法、超聲波提取法及組織破碎法測得的丹參酮ⅡA平均含量(n=5)分別為0.229%,0.251%,0.314%,RSD分別為為1.6%,1.4%,2.7%;丹參酚酸B平均含量(n=5)為分別為1.81%,1.55%,2.46%,RSD分別為1.2%,0.73%,1.9%。表明方法重復性良好。2.7內(nèi)a峰面積的rsd將加熱回流、超聲、組織破碎3種提取方法制得的供試品溶液,每隔2h分別測定1次,結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為2.0%,1.2%,2.0%;丹參酚酸B峰面積的RSD分別為0.9%,1.5%,1.2%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8均回收率及rsd采用標準加入法,加熱回流提取法、超聲波提取法及組織破碎法測得的丹參酮ⅡA的平均回收率(n=5)分別為97.11%,96.30%,95.90%,RSD分別為2.4%,1.4%,2.5%;丹酚酸B的平均回收率(n=5)分別為98.07%,98.41%,97.85%,RSD分別為1.7%,0.49%,1.9%。2.9相關(guān)提取法超聲波、組織破碎法取不同提取方法丹參的供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,用外標法計算。不同提取工藝比較及含量測定結(jié)果見表1,色譜圖見圖1。續(xù)表A.加熱回流提取法(heatingandrefluxingextraction)B.超聲波提取法(ultrasonicextraction)C.組織破碎提取法(smashingextraction)D.丹參酮ⅡA對照品(referencesubstanceoftanshinoneⅡA)E.丹酚酸B對照品(referencesubstanceofsalvianolicacidB)1.丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)2.丹酚酸B(salvianolicacidB)3討論3.1不同提取方法對參中糖酚酸b含量測定的影響中藥提取新工藝與新設(shè)備的開發(fā)研究,是中藥現(xiàn)代化的前提和擬待解決的關(guān)鍵技術(shù)之一,然而我們至今無論在實驗室還是在生產(chǎn)中,仍然多用的是一些傳統(tǒng)提取工藝與設(shè)備,如水煎煮提取法、回流提取法等,這些傳統(tǒng)提取工藝均存在著耗能、費時、提取效率低、破壞有效成分等不足,中藥提取新工藝研究的嚴重滯后影響了中藥現(xiàn)代化的進程。本實驗利用加熱回流提取法、超聲波提取法和組織破碎提取法提取丹參中丹參酮和丹參酚酸并測定含量,結(jié)果表明不同的提取方法對丹參中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量測定的影響較大?！伴W式提取器”(專利號:ZL200520031604.9)是運用組織破碎提取原理設(shè)計的中藥提取新設(shè)備,試驗結(jié)果也同時表明組織破碎提取法較其他2種提取方法有著突出的優(yōu)越性:提取效率高(丹參酮ⅡA和丹參酚酸B含量均高出其他2種方法),而且大幅度地節(jié)約了能量、時間和溶劑,是一種值得推廣應(yīng)用的高科技提取新工藝。3.2提取溶劑的選擇為有效地將丹參中脂溶性和水溶性成分同時提取出來,使工藝更加簡單經(jīng)濟,經(jīng)過文獻查閱和前期試驗研究,利用75%乙醇作為溶劑,經(jīng)過3次提取,能較好地完成2種不同極性成分的同時提取,并且75%乙醇溶劑較之其他溶劑具