尼羅紅熒光染色在小球藻中的應(yīng)用

尼羅紅熒光染色在小球藻中的應(yīng)用

微藻具有豐富的脂質(zhì)、高效率、適宜環(huán)境、短生長周期長、生物產(chǎn)量高等特征。它是國內(nèi)外生物生產(chǎn)的理想原材料。篩選脂質(zhì)含量高的微藻,成為當(dāng)前能源微藻資源開發(fā)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。微藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量是決定以微藻為原料制備生物能源的關(guān)鍵,也是能否實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的主要因素之一。目前,傳統(tǒng)的微藻脂質(zhì)測定方法主要是有機(jī)溶劑提取稱重的方法,但原料需求量大,效率低,安全性差,存在一定的局限性,無論是對優(yōu)良藻種的篩選,培養(yǎng)條件的優(yōu)化或是藻采收時(shí)期的確定,建立快速簡便低能耗的微藻脂質(zhì)測定方法尤為重要。尼羅紅(9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one)是一種脂溶性的熒光染料,能夠與脂類物質(zhì)(包括甘油酯、磷脂、蠟以及各種脂肪酸)相結(jié)合,選擇合適的激發(fā)波長可顯示強(qiáng)烈桔紅色熒光(發(fā)射波長480nm)。因此,可以利用尼羅紅與脂類物質(zhì)結(jié)合發(fā)出的熒光檢測信號,對細(xì)胞內(nèi)的脂類含量進(jìn)行快速、靈敏、可靠的活體定量測定。這種方法被廣泛用于各種細(xì)胞,也被成功作為熒光探針檢測Isochrysisgalbana,EmilianiaHuxleyi和Crypthecodiniumcohnii等一些藻類的脂質(zhì)含量。目前該方法應(yīng)用較多是屬于硅藻綱、黃藻綱、褐藻綱的藻,而很少有應(yīng)用到綠藻綱中。傳統(tǒng)的尼羅紅染色是以水溶液為媒介進(jìn)行染色的,以往研究發(fā)現(xiàn)屬于綠藻綱的一些小球藻的脂質(zhì)并不能用該方法測定,可能是由于較厚的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)阻止了尼羅紅染料穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜,使其不能有效地與胞內(nèi)脂質(zhì)相結(jié)合。小球藻是一類重要的可以作為脂質(zhì)來源的微藻,為了能用尼羅紅熒光法分析這一類藻細(xì)胞中的脂質(zhì),本文以4株小球藻為材料,通過物理和化學(xué)的預(yù)處理,提高尼羅紅染色的有效性,優(yōu)化尼羅紅熒光法檢測胞內(nèi)脂質(zhì)的條件,建立便捷快速的檢測小球藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的方法。1材料和方法1.1角褐指藻藻株選用了4株小球藻ChlorellapyrenoidosaNo.1、ChlorellapyrenoidosaNo.2、ChlorellavulgarisNo.1、ChlorellavulgarisNo.2和1株三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum(均來自中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室),經(jīng)抗生素法制備無菌藻株。1.2培養(yǎng)基和試劑小球藻的活化和培養(yǎng)采用改進(jìn)的Bristol’ssolution培養(yǎng)基(g/L):NaNO30.25,K2HPO4·3H2O0.075,MgSO4·7H2O0.075,CaCl2·2H2O0.025,KH2PO40.175,NaCl0.025,FeCl3·6H2O0.005,Fe-EDTA(0.49g/L)1mL,A5微量元素液1mL。其中A5微量元素液(g/L):ZnSO4·7H2O0.22,H3BO32.86,MnCl2·4H2O1.81,CuSO4·5H2O0.079,(NH4)6MO7O24·4H2O0.039,土壤提取液1mL。Phaeodactylumtricornutum采用f/2培養(yǎng)基。250mL三角瓶中裝100mL液體培養(yǎng)基,接種量10%,28℃靜置培養(yǎng),光照強(qiáng)度4500lx,光暗比為12∶12(h/h),每日隨機(jī)調(diào)換三角瓶并搖動2~3次懸浮藻細(xì)胞。1.3熒光強(qiáng)度的測定取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的藻液適量,8000r/min離心5min,去除上清,藻細(xì)胞沉淀用PBS緩沖溶液洗兩次,用PBS重懸藻細(xì)胞至OD540值0.8,1mL藻液加15μL尼羅紅染料(質(zhì)量濃度為0.1mg/mL丙酮溶液),室溫下混勻染色5min,激發(fā)波長480nm,測定其在575nm波長的熒光強(qiáng)度。除了特殊說明,以下所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行。1.4脂質(zhì)層的提取提取溶劑為氯仿-甲醇混合溶液(體積比為2∶1),室溫下在0.3g藻粉中加入3mL提取溶劑,超聲提取約10min,6000r/min離心5min,取固體層以下脂質(zhì)層,重復(fù)此步驟3~5次。合并所有脂質(zhì)層溶液于已恒重好的離心管中,于80℃水浴蒸干溶劑,放入40℃烘箱中過夜干燥至恒重,計(jì)算脂質(zhì)含量。1.5處理數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPadPrism5的單因素方差分析(ANOVA)中的Dounnett多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析。2結(jié)果與分析2.1p.trcornutum的脂質(zhì)含量圖1是尼羅紅染色后檢測到的5株藻的熒光強(qiáng)度,4株小球藻都只有很微弱的熒光強(qiáng)度(2.50~5.13)。三角褐指藻P.tricornutum產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度達(dá)到51.68,是4株小球藻熒光強(qiáng)度的10倍以上。通過稱重法測定P.tricornutum的脂質(zhì)含量為17.4%,4株小球藻的脂質(zhì)含量在14%~19%內(nèi),與P.tricornutum脂質(zhì)含量相差不大。這種溶劑提取稱重法與尼羅紅染色熒光強(qiáng)度的巨大差別,與Chen等的研究結(jié)果一致,可以認(rèn)為尼羅紅染色法的有效性和微藻的分類及結(jié)構(gòu)有關(guān)系。P.tricornutum屬于褐藻綱,胞內(nèi)脂質(zhì)與尼羅紅能夠較好結(jié)合,而屬于綠藻綱的4株小球藻則可能由于尼羅紅染料不能與細(xì)胞中的脂質(zhì)有效結(jié)合而導(dǎo)致發(fā)射的熒光強(qiáng)度較低。可見同一染色條件下不同藻種的熒光強(qiáng)度并不能作為脂質(zhì)含量的指示。2.2采用尼羅紅染色法測定小球藻脂質(zhì)法的優(yōu)化2.2.1不同濃度甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮的絡(luò)合萃取對藻細(xì)胞的預(yù)處理的影響傳統(tǒng)尼羅紅染色法不能有效測定小球藻中的脂質(zhì)含量,如果能找到一種處理方法來影響細(xì)胞壁和質(zhì)膜的完整性以促進(jìn)尼羅紅染料與脂質(zhì)的結(jié)合,從而發(fā)射出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的藻液適量,8000r/min離心5min,去除上清,藻細(xì)胞沉淀用PBS洗兩次,分別采用20%的甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、二甲基亞砜水溶液,水以及PBS緩沖溶液,重懸藻細(xì)胞至OD540值0.8,35℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼羅紅染料(質(zhì)量濃度為0.1mg/mL丙酮溶液),混勻染色5min,激發(fā)波長480nm,測定其在575nm波長的熒光強(qiáng)度,結(jié)果見圖2。圖2顯示,與水和PBS緩沖液相比,20%的甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮的處理并沒有增加藻的熒光強(qiáng)度,而20%的二甲基亞砜(DMSO)對藻的預(yù)處理得到了較高的熒光強(qiáng)度。DMSO能夠改變生物膜對電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性,促進(jìn)了尼羅紅染料進(jìn)入藻細(xì)胞。因此,選擇20%的DMSO水溶液重懸藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。2.2.2dmso體積分?jǐn)?shù)對染色的影響取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的藻液適量,8000r/min離心5min,去除上清,藻細(xì)胞沉淀用PBS洗兩次,分別采用不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO(0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)水溶液重懸藻細(xì)胞,使藻液OD540值0.8,40℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼羅紅染料(質(zhì)量濃度為0.1mg/mL丙酮溶液),混勻染色5min,激發(fā)波長480nm,測定其在575nm波長的熒光強(qiáng)度,考察DMSO體積分?jǐn)?shù)對染色的影響,結(jié)果見圖3。2.2.3預(yù)處理溫度對染色的影響按2.2.2方法,采用20%DMSO水溶液預(yù)處理,分別在不同溫度下(20、30、35、40、45、50、55、60℃)水浴20min,考察預(yù)處理溫度對染色的影響,結(jié)果見圖4。2.2.4尼羅紅染料用量的確定按2.2.2方法,采用20%DMSO水溶液稀釋藻液,在40℃水浴20min,按1mL藻液加入不同體積質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的尼羅紅染料丙酮溶液,考察不同尼羅紅染料用量對染色的影響,結(jié)果見圖5。圖5顯示,尼羅紅染料用量在5~15μL之間時(shí),4株小球藻的熒光強(qiáng)度均隨尼羅紅染料用量的增加而逐漸增強(qiáng),在15μL時(shí)達(dá)到最大,超過15μL時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸減弱。2.2.5藻細(xì)胞密度對染色的影響取對數(shù)生長期后期藻細(xì)胞用20%DMSO水溶液按不同比例稀釋,得到一系列細(xì)胞密度不同的藻液(以O(shè)D540表征),然后40℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼羅紅染料(質(zhì)量濃度0.1mg/mL丙酮溶液),混勻染色5min,激發(fā)波長480nm,測定其在575nm波長的熒光強(qiáng)度,考察藻細(xì)胞密度對染色的影響,結(jié)果見圖6。2.3尼羅紅染色法的熒光強(qiáng)度與重復(fù)性對比圖7是對4株小球藻分別用傳統(tǒng)尼羅紅染色法,改進(jìn)的尼羅紅染色法和稱重法進(jìn)行測定的結(jié)果。與傳統(tǒng)尼羅紅染色法相比,改進(jìn)的尼羅紅染色法的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(p<0.01),重復(fù)性也很好。說明改進(jìn)的尼羅紅染色法可以實(shí)現(xiàn)厚壁小球藻的染色,更為準(zhǔn)確地反映胞內(nèi)脂質(zhì)含量,可以用作綠藻脂質(zhì)含量的快速篩選。3尼羅紅染色法針對一些小球藻的尼羅紅不易染色的問題,選取4株小球藻為材料,通過物理和化學(xué)的預(yù)處理,提高了尼羅紅染色的有效性。優(yōu)化的小球藻細(xì)胞脂質(zhì)尼羅紅活體染色的條件為:使用20%的DMSO作為滲透劑,在水浴溫度35~40℃下對OD540值為0.8~1.1的藻液進(jìn)行預(yù)處理,然后以1mL藻液用15μL質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的尼羅紅丙酮溶液進(jìn)行染色。改進(jìn)的尼羅紅染色法加強(qiáng)了尼羅紅染料與小球藻脂質(zhì)的結(jié)合,所發(fā)射的熒光強(qiáng)度較好地反映了小球藻細(xì)胞脂質(zhì)的含量。與傳統(tǒng)的稱重法比較,該方法具有原料需求少、效率高、低能耗的特點(diǎn),可以作為篩選高脂質(zhì)含量綠藻的快速檢測方法。圖3顯示,當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO處理4株小球藻時(shí),均出現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用體積分?jǐn)?shù)20%的DMSO水溶液預(yù)處理