綠豆過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)方法的建立

綠豆過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)方法的建立

近年來(lái)，食物過(guò)敏患者的數(shù)量有所增加。根據(jù)研究，世界上大約15%的食物過(guò)敏患者。在日本,經(jīng)常發(fā)生居民因食用雞蛋、牛奶、小麥、蕎麥、小蝦和豌豆等食物引起過(guò)敏反應(yīng)的事例。在美國(guó),2%的成人、5%的兒童患有食品過(guò)敏癥,美國(guó)每年發(fā)生大約30000例食物過(guò)敏反應(yīng),而且這一數(shù)字還在增長(zhǎng)中。近幾年,我國(guó)人群食物過(guò)敏現(xiàn)象日趨增多,對(duì)其的關(guān)注也越來(lái)越多,但目前我國(guó)對(duì)于過(guò)敏原的監(jiān)管還未到位。過(guò)敏原檢測(cè)是有效監(jiān)管也是避免食物過(guò)敏造成健康危害的主要手段。雖然綠豆不是主要過(guò)敏原,但是綠豆是一種常見(jiàn)的食品加工原料,綠豆蛋白質(zhì)高達(dá)19.5%~33.1%,也曾有綠豆過(guò)敏的報(bào)道。至今沒(méi)有建立綠豆過(guò)敏原的特異性檢測(cè)方法。本文通過(guò)制備綠豆過(guò)敏原、動(dòng)物免疫,制備綠豆過(guò)敏原多克隆抗體,建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,為食品中綠豆過(guò)敏原的快速篩選提供有效方法。1材料和方法1.1儀器、檢測(cè)方法弗氏佐劑、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250(Sigma,美國(guó)),紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Varian,美國(guó)),蛋白電泳儀(BIO-RAD,美國(guó)),真空冷凍干燥器(Christ,德國(guó)),酶標(biāo)儀(Thermo,美國(guó))。1.2碳酸鈉緩沖液及底物體系溶液0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4),0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6),洗滌緩沖液(含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液),封閉液(0.5%脫脂乳粉),底物體系溶液(TMB-過(guò)氧化氫脲溶液),1.25mol/L的H2SO4溶液。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性新西蘭大耳白兔,月齡3個(gè)月,體重1.5kg,潔凈等級(jí):SPF級(jí)。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,用不含有綠豆組分飼料常規(guī)喂養(yǎng)。1.4綠豆粉的提取綠豆(購(gòu)自天津樂(lè)購(gòu)超市)用高速粉碎機(jī)粉碎后,稱取50.0g,加入100mL丙酮,于4℃下低速攪拌4~5h除脂,抽濾至綠豆粉中無(wú)丙酮為止。將綠豆粉轉(zhuǎn)移至離心管中加入50mL雙蒸水,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至9.0,在振蕩器上混勻后,4000r/min離心15min取上清液。上清用1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0,出現(xiàn)大量沉淀,在振蕩器上混勻后,4000r/min離心15min后取沉淀。上清液重復(fù)提取2次后,將離心得到的沉淀合并,在真空冷凍干燥儀中凍干成粉末,在-20℃中保存?zhèn)溆谩?.5綠色蛋白定量蛋白溶液定量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。1.6-糖酸酯酶系統(tǒng)的檢測(cè)提取后的綠豆蛋白通過(guò)SDS法進(jìn)行分析。所采用的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為BluePlusⅡProteinMarker(14~100ku),凝膠為Mini-PRO-TEANTGXPrecastGels(分離膠濃度3%~15%),電泳設(shè)備為Mini-PROTEANElectrophoresiscell。樣品的處理:取5μL綠豆蛋白溶液(1mg/mL)至eppendorf管中,加入5μL上樣緩沖液,在100℃沸水浴中煮沸10min,取出冷卻后上樣。上樣量為每孔10μL。蛋白Marker上樣量為5μL每孔。80V恒壓,電泳1.5~2.0h。然后將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中,置于搖床上室溫下染色過(guò)夜。次日用脫色液脫色,至蛋白條帶清晰。1.7血清學(xué)檢測(cè)血清效價(jià)免疫動(dòng)物選擇新西蘭大耳白兔,月齡3個(gè)月,體重1.5kg,飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中,連續(xù)觀察7d,確定身體狀況正常后進(jìn)行免疫。免疫途徑為皮下注射和肌肉注射。設(shè)置空白對(duì)照組,即免疫方式、免疫周期、免疫次數(shù)和免疫佐劑均相同,免疫時(shí)注射磷酸鹽緩沖液和免疫佐劑的混合物。第5次免疫后第7~10天取全血。采集到的血液先在37℃下凝固2h,然后置4℃冰箱中過(guò)夜,使血塊收縮。將血塊自容器壁分離,血清全部?jī)A入離心管,血塊于4℃,4500r/min離心20min,合并血清,置于-20℃冰箱中保存,備用。用間接酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗血清效價(jià)。得到的血清。采用ProteinA-Sepharose4B親和層析純化抗體。所得抗體用PBS透析后,加入等體積的丙三醇,于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.8蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)包被:96孔酶標(biāo)板中加入經(jīng)包被液稀釋的綠豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,100μL/well,4℃孵育12~16h后棄去孔中液體,用PBST洗板3次,每次2min。(2)封閉:在酶標(biāo)板中加入封閉液200μL/well,室溫封閉1h后棄去封閉液,用PBST洗板3次,每次2min。(3)加樣:每孔加入50μL綠豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和50μL用PBS稀釋的兔抗體,室溫下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h,用PBST洗液洗板4次,每次2min。(4)加酶標(biāo)二抗:加入PBS稀釋10000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體,100μL/well,室溫孵育30min后用PBST洗板4次,每次2min。(5)顯色:加入底物溶液,每孔100μL,室溫暗處顯色20min。(6)終止:每孔加入50μL終止液。(7)讀數(shù):在雙波長(zhǎng)方式(450~650nm)下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值(OD值)。根據(jù)OD值按照以下公式計(jì)算抑制率。式中,A對(duì)照———PBS的平均吸光度值;A樣品———蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣液的平均吸光度值;A空白———不加入酶標(biāo)及蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。2結(jié)果與討論2.1不同分子質(zhì)量的保證提取后的綠豆蛋白通過(guò)SDS電泳法進(jìn)行分析。如下圖所示:從電泳結(jié)果可見(jiàn),提取的綠豆蛋白是多蛋白組分的混合物,含量較高的組分或片段的分子質(zhì)量為50、38、34和25ku,其中25ku的蛋白含量最高。分子質(zhì)量在63、28和18ku的蛋白或片段含量較低。為使檢測(cè)的綠豆蛋白更全面、準(zhǔn)確,試驗(yàn)選擇提取的綠豆混合蛋白進(jìn)行免疫制備抗體。2.2采集全部血清采用間接ELISA對(duì)抗血清的效價(jià)進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。效價(jià)監(jiān)測(cè)結(jié)果可見(jiàn),隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),抗血清的效價(jià)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),而第3次采血與第4次采血之后測(cè)得效價(jià)基本趨于穩(wěn)定,因此,在第4次采血時(shí)(即第5次加強(qiáng)免疫后7~10d內(nèi))可以采集全部血清。所得抗血清效價(jià)最高為32000。同種免疫原,免疫途徑免疫周期下免疫得到的兔血清效價(jià)間的差異可能是優(yōu)于動(dòng)物個(gè)體差異造成的。2.3酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立2.3.1最佳工作濃度確定為了獲得最佳的測(cè)定條件和節(jié)省測(cè)定費(fèi)用,本試驗(yàn)采用棋盤法對(duì)綠豆蛋白的包被量和抗體的稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇0.05、0.1、0.5和1.0μg/孔,4個(gè)濃度的綠豆蛋白溶液進(jìn)行包被,將抗體以不同比例進(jìn)行稀釋,HRP標(biāo)記的羊抗兔作為酶標(biāo)二抗用PBS1∶10000倍稀釋,進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析,選擇吸光度值在0.7~1.2范圍內(nèi)的抗體稀釋倍數(shù)和蛋白包被量,確定為最佳的工作濃度。結(jié)果見(jiàn)表3。由表3~表6可知,吸光度值隨著包被量的增大而增大,而隨抗體稀釋比例上升而下降。選擇1∶32000的抗體稀釋比例,包被量為0.1μg/孔和0.5μg/孔的吸光度值分別為0.971和1.093,均在1.0左右。由于蛋白的包被量對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)的靈敏度(定義為IC50值,即抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的綠豆蛋白的濃度)影響較為明顯,所以在確定的抗體稀釋比例1∶32000下,選擇上述兩個(gè)蛋白包被量繪制綠豆蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)抑制率曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖2可看出,當(dāng)綠豆蛋白的包被量為0.1μg/well時(shí),IC50明顯低于0.5μg/well的蛋白包被量,因此確定的最終工作濃度為:綠豆蛋白包被量為0.1g/well,抗體稀釋比例為1∶32000。3選擇抗監(jiān)管劑,獲得抗保證本試驗(yàn)從綠豆中提取了總蛋白,電泳分析表明為分子質(zhì)量介于18ku到63ku之間的混合蛋白,采用綠豆混合蛋白免疫新西蘭大耳白兔,獲得了抗綠豆過(guò)敏原多克隆抗體。優(yōu)化建立了綠豆過(guò)敏原間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,靈敏度為IC50=(0.72±0.035)μg/mL,檢出限為IC15=(0.72±0.035)μg/mL。2.3.2黨建蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用包被液稀釋綠豆過(guò)敏原后包被96孔酶標(biāo)板,0.1μg/well,100μL/孔,4℃包被過(guò)夜;用0.5%脫脂乳粉作為封閉液,室溫封閉1h;加入綠豆蛋白標(biāo)樣50μL/well和50μL/well用PBS稀釋的抗體,其中蛋白從5μg/mL開(kāi)始2倍梯度稀釋,抗體的稀釋倍數(shù)為1∶32000,室溫下振蕩反應(yīng)1h;加入二抗:用PBS稀釋1∶10000倍稀釋的HRP-羊抗鼠,室溫