魚(yú)油中高度不飽和脂肪酸的提取

魚(yú)油中高度不飽和脂肪酸的提取

在動(dòng)物體內(nèi)，例如epa和體重指數(shù)的脂肪酸（puf）的獨(dú)特生理效果已被科學(xué)、學(xué)術(shù)界、健康食品產(chǎn)業(yè)和消費(fèi)者所喜愛(ài)。在英、美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家,健康部門(mén)推薦每個(gè)成人ω-3型多不飽和脂肪酸的攝入量應(yīng)為1.0~1.5g/d;有關(guān)DHA的產(chǎn)品,如DHA保健膠囊、DHA嬰兒奶粉、DHA微膠囊制品、DHA飲料及DHA食品也已相繼誕生,而EPA也在90年代初就被日本正式批準(zhǔn)用于治療心血管疾病的藥物。水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)PUFA(尤其是魚(yú)蝦體內(nèi)自身不能合成或合成速度緩慢的PUFA,如亞油酸、亞麻酸、EPA、DHA等)在魚(yú)蝦生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中適量投放富含PUFA的生物餌料已經(jīng)成為增產(chǎn)增收的一個(gè)重要手段。隨著研究的繼續(xù)深入,EPA和DHA新的生理功效及作用機(jī)理將不斷被發(fā)現(xiàn)和揭示,然而短缺的PUFA生物資源卻始終制約著EPA和DHA的廣泛應(yīng)用,積極尋找廉價(jià)的DHA和EPA生物資源已成為一種迫切的要求。國(guó)外較早就開(kāi)展了PUFA生物資源開(kāi)發(fā)和利用的研究工作,尤其是DHA和EPA生物資源,發(fā)現(xiàn)海洋微藻具有大規(guī)模生產(chǎn)PUFA的潛力;到目前為止,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)在這個(gè)方面進(jìn)行了比較廣泛的研究,并取得了不少成就。1酶法生產(chǎn)-3型多飽和脂肪酸傳統(tǒng)上工業(yè)魚(yú)油是DHA和EPA等多不飽和脂肪酸的主要來(lái)源,尤其是深海魚(yú)油。然而從魚(yú)油中提取PUFA時(shí)卻經(jīng)常面臨著這樣的問(wèn)題:(1)魚(yú)油中的ω-3型PUFA(主要是DHA/EPA)的構(gòu)成和含量隨著魚(yú)的種類、季節(jié)、地理位置等變化而變化;(2)從魚(yú)油中提取的PUFA膽固醇含量高,并帶有腥味,極大地影響了產(chǎn)品的品質(zhì);(3)在魚(yú)油加工過(guò)程中的氫化處理工藝降低了魚(yú)油中的PUFA產(chǎn)量;(4)復(fù)雜的加工處理過(guò)程,使得PUFA的價(jià)格極為昂貴。研究人員近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)許多真菌中有積累DHA和EPA的現(xiàn)象。在高山被孢霉(Motierellaalpina)、樟疫霉(Phtophhoracinnamomi)、終極腐霉(Pythiumultimum)、長(zhǎng)孢被孢霉(M.elongata)、畸雌腐霉(P.Irregular)等真菌中發(fā)現(xiàn)了EPA的存在,在破囊壺菌(Thraustochytriumsp.)和裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)等海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了DHA積累,最近XGuo和Yota甚至在酵母FO726A中也發(fā)現(xiàn)了DHA和EPA的積累。利用真菌生產(chǎn)DHA和EPA的工作還處于嘗試和探索階段,如果僅采用現(xiàn)有的真菌菌種和技術(shù)生產(chǎn)DHA和EPA仍然存在成本偏高,工藝流程不成熟,對(duì)外界因子干擾敏感,產(chǎn)量有限等問(wèn)題。因此,積極開(kāi)發(fā)和利用廉價(jià)的EPA和DHA生物資源和研究便捷的培養(yǎng)和生產(chǎn)方式便成為了廣大商家和科學(xué)工作者們共同關(guān)心的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)類并不是PUFA的真正生產(chǎn)者,它是通過(guò)吞食富含PUFA的藻類(海洋微藻→浮游動(dòng)物→魚(yú))后在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)PUFA的積累,因此微藻才是PUFA真正的生產(chǎn)者。培養(yǎng)海洋微藻生產(chǎn)ω-3型多不飽和脂肪酸理論上講應(yīng)該是一條更為直接的途徑。一方面,海洋微藻可以快速生長(zhǎng)繁殖、自身合成并富集高濃度的PUFA,在某些微藻體內(nèi)PUFA的含量高達(dá)細(xì)胞干重的5%~6%,其相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于魚(yú)體內(nèi)PUFA的含量(表1)。另一方面,從藻體內(nèi)提純PUFA較從魚(yú)油中提取工藝更為簡(jiǎn)單,并且不帶腥味,適合于作優(yōu)質(zhì)食品添加劑。同時(shí),它不含膽固醇成分,避免了服用魚(yú)油膠囊時(shí)攝入大量膽固醇的缺點(diǎn)。有些微藻還可以直接食用,大大減少了PUFA在提純過(guò)程中的氧化分解。2微藻的相對(duì)生物多樣性利用海洋微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究始于80年代初期,并且多以自養(yǎng)微藻生產(chǎn)DHA和EPA為主,其中的三角褐紫藻(P.tricornutum)、紫球藻(Porphyridiumcruentum)、鹽生微小綠藻(Nannochloropisissalina)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、硅藻(Diatom)等當(dāng)時(shí)被認(rèn)為最有可能實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)化。美國(guó)、日本、以色列等曾率先采用戶外開(kāi)放大池培養(yǎng)這些自養(yǎng)微藻用以生產(chǎn)PUFA,其結(jié)果并不盡人意。Cohen和Heimer報(bào)道,戶外培養(yǎng)紅藻(Porphyidiumcruentum)的EPA產(chǎn)量冬天為0.5mg/(L·d),夏天為1.0mg/(L·d)。Barelay等據(jù)Richmond和Vonshak1982年報(bào)道戶外培養(yǎng)微藻的最高產(chǎn)量50g/(m2·d),和LopezAlonso等1992年實(shí)驗(yàn)研究中報(bào)告的自養(yǎng)微藻品系中ω-3型多不飽和脂肪酸最高含量值(在Isochrysisgalbana中占干重6.7%),對(duì)戶外培養(yǎng)積累多不飽和脂肪酸的光合自養(yǎng)微藻最高產(chǎn)量進(jìn)行了理論推斷,其值也僅為16.7mg/(L·d)。我國(guó)微藻養(yǎng)殖方面發(fā)展較快,養(yǎng)殖方式也比較一致,都是采用開(kāi)放式或半開(kāi)放式的培養(yǎng)方式,培養(yǎng)一些可以作為生物餌料或者食品添加劑的藻種;對(duì)于開(kāi)放大池培養(yǎng)微藻用以生產(chǎn)PUFA研究得不多,戴俊彪等曾對(duì)開(kāi)放大池培養(yǎng)球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)生產(chǎn)DHA和EPA進(jìn)行過(guò)初步的探討。其間,人們也對(duì)影響微藻生長(zhǎng)繁殖、藻體生化組成和PUFA積累的稀釋速率、光照強(qiáng)度、光質(zhì)及光周期、溫度、pH、鹽度、氮源及濃度和磷源及濃度、NaCl濃度、微量元素、微生素及二氧化碳等影響因子也進(jìn)行了深入探討,并擬定了不少自養(yǎng)微藻高產(chǎn)PUFA的最佳培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件。這些工作從一定程度上彌補(bǔ)了戶外開(kāi)放大池培養(yǎng)微藻的一些不足,在一定范圍內(nèi)提高了微藻培養(yǎng)過(guò)程中的單位面積上單位時(shí)間的生物產(chǎn)量及產(chǎn)物的積累,然而這仍不能從根本上克服戶外培養(yǎng)海洋微藻的諸多不利因素。開(kāi)放大池培養(yǎng)微藻其極低的產(chǎn)量和難以對(duì)一些高純度、高價(jià)值的產(chǎn)品進(jìn)行純種培養(yǎng)的缺陷,使其在推廣微藻大規(guī)模培養(yǎng)上受到諸多因素的限制。首先,能適應(yīng)于大池培養(yǎng)的微藻藻種必須是在極端環(huán)境下能快速生長(zhǎng)的藻種,然而能滿足這些條件的藻種目前并不是太多。其次,培養(yǎng)過(guò)程受光照、溫度等自然環(huán)境影響較大,并且易被真菌、原生動(dòng)物和其他雜藻污染,同時(shí)水分蒸發(fā)嚴(yán)重,二氧化碳供給不足。這些因素最終都將導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)密度偏低,PUFA含量不高,使得采收成本過(guò)高。后來(lái),人們又設(shè)計(jì)出密閉光生物反應(yīng)器,基本上可以解決上述問(wèn)題,并通過(guò)控制培養(yǎng)液濃度實(shí)現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)?，F(xiàn)在的光生物反應(yīng)器已經(jīng)發(fā)展為柱式光照發(fā)酵罐、管式及板式恒化反應(yīng)器,以及可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)條件計(jì)算機(jī)在線控制的光纖式光生物反應(yīng)器等多種類型。3表面活性劑pahs和異養(yǎng)藻pufa的選育利用密閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻,能夠最大限度的控制養(yǎng)殖環(huán)境,減少污染發(fā)生,提高產(chǎn)量。據(jù)Cohen和Arad報(bào)道,利用這一技術(shù)可使Porphyridium的產(chǎn)量增加60%~300%,同時(shí)還可以降低收獲成本。然而利用光生物反應(yīng)器依然存在著許多不足:如培養(yǎng)后期,由于細(xì)胞濃度的升高,限制光的穿透,降低了光照效率;在培養(yǎng)過(guò)程中由于水壓增加,使細(xì)胞受到損傷;反應(yīng)器內(nèi)容易累積氧氣,降低脂肪酸的去飽和程度;反應(yīng)器和生物傳感器上易發(fā)生附著;此外這種培養(yǎng)技術(shù)成本較高。如果能實(shí)現(xiàn)異養(yǎng)培養(yǎng),像許多工業(yè)微生物一樣在發(fā)酵罐里實(shí)行工業(yè)化生產(chǎn),則可以避免上述問(wèn)題。早在60年代異養(yǎng)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)技術(shù)就應(yīng)用于健康食品、動(dòng)物飼料、蝦青素和抗壞血酸的生產(chǎn)。另外,KhozinI等也對(duì)ω-3型PUFA的合成代謝途徑進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)ω-3型PUFA的合成過(guò)程并不需要光照;Johns等則先后從眾多積累PUFA的微藻中也篩選出能異養(yǎng)藻種,如:群孢小球早(Chlorellasorokinana),小球藻(C.saccharophia),柯氏隱甲藻(Crypteodiniumcohnii),菱形藻(Nitzschiaalba),卡德藻(Tetraselmissuecica),單衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。因此,選育富集DHA和EPA的異養(yǎng)藻種,設(shè)計(jì)適合的培養(yǎng)基及選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件,實(shí)現(xiàn)微藻大規(guī)模異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)PUFA是完全可能,而且也是可行的。這樣一來(lái)便可以做到:(1)以現(xiàn)有的發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行微藻純種培養(yǎng)制造高值產(chǎn)品,減少設(shè)備投資;(2)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)條件自動(dòng)化控制,使藻細(xì)胞快速生長(zhǎng)繁殖,提高培養(yǎng)基單位容積的產(chǎn)率;(3)達(dá)到高效利用底物,提高細(xì)胞密度,利用現(xiàn)有的分離設(shè)備降低采收和產(chǎn)物提純等下游技術(shù)的成本。與自養(yǎng)微藻培養(yǎng)、采收和其最終產(chǎn)物的分離純化等工藝相比,異養(yǎng)培養(yǎng)的確更為有效可行。如今,國(guó)外異養(yǎng)微藻藻種選育工作已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。美國(guó)Martek公司篩選出硅藻種Nitzschiaalba作為EPA生產(chǎn)藻種,其EPA的最終產(chǎn)量為0.25g/(L·d);篩選出的DHA生產(chǎn)藻種Crythecodiniumcohnii,其DHA的產(chǎn)率為1.2g/(L·d),該公司已建成150m3規(guī)模的工業(yè)化異養(yǎng)培養(yǎng)設(shè)備,生產(chǎn)富含DHA的微藻飼料。日本川崎制鐵公司篩選出DHA生產(chǎn)藻種Crypthecodiniumsp.并申請(qǐng)了專利。國(guó)內(nèi)在這方面工作還處于嘗試階段,如研究人員曾考慮試圖通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)將海洋小球藻與不含EPA但生長(zhǎng)快速的淡水小球藻進(jìn)行融合獲得能快速合成DHA和EPA的新型雜合小球藻,或者通過(guò)探索其他技術(shù)或者新的方法以期獲得一些生產(chǎn)PUFA的新型藻種。此外,研究人員對(duì)異養(yǎng)培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究。Chen,MichaelR和Johns等發(fā)現(xiàn)以發(fā)酵技術(shù)為基礎(chǔ),采用恒化培養(yǎng)、分批流加培養(yǎng)和膜過(guò)濾細(xì)胞循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行微藻異養(yǎng)培養(yǎng),不僅可以降低初始底物濃度過(guò)高或者過(guò)低對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制或限制作用,而且可以排除培養(yǎng)液中影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)的有毒物質(zhì)和細(xì)胞溶出物,保證藻細(xì)胞高密度培養(yǎng)的順利進(jìn)行。同時(shí),進(jìn)行培養(yǎng)基的徹底滅菌、嚴(yán)格無(wú)菌操作及優(yōu)化培養(yǎng)條件,也可解決異養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)容易污染細(xì)菌等微生物的問(wèn)題。最近一項(xiàng)由中山大學(xué)和香港大學(xué)聯(lián)合研制開(kāi)發(fā)的深海植物生物反應(yīng)器高密度深層培養(yǎng)技術(shù),已被汕頭潤(rùn)科生物工程有限公司成功用于生產(chǎn)DPA(二十二碳五烯酸)和不含EPA的DHA長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。眾所周知,并不是所有微藻都能以有機(jī)碳源為底物進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng),且對(duì)微藻異養(yǎng)機(jī)理的研究也還不夠深入。對(duì)于那些只能自養(yǎng),還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其異養(yǎng)或者兼養(yǎng)現(xiàn)象的微藻,人們推測(cè)其可能是由于酶缺陷機(jī)制、膜障礙機(jī)制和異養(yǎng)代謝能量不足機(jī)制所致。當(dāng)前,研究人員對(duì)微藻異養(yǎng)機(jī)理、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型、培養(yǎng)條件等工作繼續(xù)進(jìn)行深入細(xì)致地研究的同時(shí),對(duì)異養(yǎng)藻種的選育工作也正緊張開(kāi)展。微藻藻種的選育方法很多,如選擇育種、誘變育種、基因工程和細(xì)胞工程育種等,而對(duì)于異養(yǎng)微藻藻種選育工作來(lái)說(shuō),后3種方法卻還處于嘗試和探索階段。目前中國(guó)科學(xué)院等離子物理研究所離子束生物工程中心正擬定利用離子束生物工程技術(shù)開(kāi)展微藻育種工作,離子束生物技術(shù)是一項(xiàng)頗受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者和育種專家關(guān)注的新興生