目的基因的克隆-PCR法擴(kuò)增目的基因片斷課件

目的基因的克隆—

PCR法擴(kuò)增目的基因片斷PCR(PolymeraseChainReaction)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),模擬了發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制的過(guò)程目的基因的克隆—

PCR法擴(kuò)增目的基因片斷PC1DNA的結(jié)構(gòu)（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脫氧核糖核苷dNTP三磷酸雙脫氧核糖核苷ddNTPDNA的結(jié)構(gòu)（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脫氧核糖核苷dN2DNA的結(jié)構(gòu)（2）A腺嘌呤G鳥(niǎo)嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶

五種堿基A-TC-GDNA的結(jié)構(gòu)（2）A腺嘌呤五種堿基A-TC-G3DNA的結(jié)構(gòu)（3）氫鍵維持了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA的結(jié)構(gòu)（3）氫鍵維持了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)4DNA的復(fù)制（1）3’-OH進(jìn)攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’DNA的復(fù)制（1）3’-OH進(jìn)攻5’-Pi5DNA的復(fù)制（2）DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在復(fù)制起始點(diǎn)打開(kāi)雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結(jié)合到單鏈DNA上進(jìn)一步解開(kāi)雙鏈DNADNA的復(fù)制（2）DNA復(fù)制相關(guān)蛋白6DNA的復(fù)制（3）DNA的復(fù)制（3）7DNA的復(fù)制和體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入打開(kāi)雙鏈解鏈酶加熱變性維持單鏈單鏈結(jié)合蛋白高溫引物引物合成酶外源加入底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液DNA的復(fù)制和體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞8PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性9PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性10PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性11PCR循環(huán)—退火PCR循環(huán)—退火12PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸13PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸14PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸15PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸16PCR整個(gè)過(guò)程PCR整個(gè)過(guò)程17討論1：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其是第一次反應(yīng)的模板防止非特異性的引物退火延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度

DNA聚合酶不能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶

常規(guī)用的PCRDNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來(lái)的DNA聚合酶。酶活性在1000C條件下，能保持幾個(gè)小時(shí)。而其最適合酶促溫度在720C左右。

討論1：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其18討論2：影響PCR質(zhì)量的一些因素模板:選用純度較高的DNA作模板，雜質(zhì)蛋白和RNA的存在都會(huì)影響到DNA聚合酶與引物和模板的結(jié)合。目的片斷：目的片斷或者目的片斷相鄰的DNA含GC量較高，或者有重復(fù)序列存在，都會(huì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在?？稍诜磻?yīng)體系里加入DMSO，破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物的設(shè)計(jì)：引物太短，要求退火的溫度就低，錯(cuò)配的可能性就大，再者，兩條引物不能存在較長(zhǎng)的互補(bǔ)片斷。酶：純度、可信度，堿基錯(cuò)配率<1/10000。討論2：影響PCR質(zhì)量的一些因素模板:選用純度較高的DNA作19討論3：PCR的應(yīng)用從藍(lán)藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由基抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰食品、保健品、藥品、化妝品基因庫(kù)檢索

SOD的序列

設(shè)計(jì)引物

以藍(lán)藻總DNA位模板做PCR獲得的基因片斷連接在表達(dá)載體原核表達(dá)蛋白討論3：PCR的應(yīng)用從藍(lán)藻里面克隆SOD清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由20討論3：PCR的應(yīng)用檢測(cè)粉末樣品是否含有炭疽桿菌

炭疽菌恐慌，降臨美國(guó)，席卷全球生命力強(qiáng)、傳染快、發(fā)作快、死亡率高。有兩對(duì)引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌EF因子的基因序列設(shè)計(jì)的，僅與各種炭疽桿菌的EF因子同源。PCR產(chǎn)物是1247bp和208bp的片斷。非炭疽桿菌均呈陰性。用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2小時(shí)取培養(yǎng)液直接作PCR討論3：PCR的應(yīng)用檢測(cè)粉末樣品是否含炭疽菌恐慌，降臨美國(guó)，21討論3：PCR的應(yīng)用基因測(cè)序基因組計(jì)劃首要任務(wù)就是測(cè)序Sanger雙脫氧法ddATP-綠色熒光ddTTP-紅色熒光ddCTP-藍(lán)色熒光ddGTP-橙色熒光討論3：PCR的應(yīng)用基因測(cè)序基因組計(jì)劃首要任務(wù)就是測(cè)序ddA22討論3：PCR的應(yīng)用基因測(cè)序討論3：PCR的應(yīng)用基因測(cè)序23實(shí)驗(yàn)步驟：1.取一個(gè)干凈PCR專用小管2.往PCR管里面加入各種試劑3.設(shè)定好機(jī)器各種參數(shù)4.開(kāi)始PCR5.電泳檢測(cè)PCR結(jié)果無(wú)菌去離子水34ul10XPCR緩沖液5uldNTP混合液4ulMg++溶液3ul引物1