蛋白質(zhì)化學(xué)3市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

6蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)多肽鏈氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，決定了蛋白質(zhì)生物學(xué)功效。組成蛋白質(zhì)22種氨基酸，側(cè)鏈基團(tuán)理化性質(zhì)和空間排布各不相同，當(dāng)它們按照不一樣序列關(guān)系組合時(shí)，形成各種多樣空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性蛋白質(zhì)分子。1/104蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為：一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。在二、三級(jí)結(jié)構(gòu)間劃分出超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。2/1043/104蛋白質(zhì)一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)4/1046.1蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)中氨基酸排列次序。5/1041953年英國(guó)Sanger等人，完成了牛胰島素(Isulin)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定工作，分子量為5700D，有A鏈(21AA)和B鏈(30AA)兩條肽鏈，兩個(gè)鏈間有二硫鍵和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(A鏈)。6/1041960年StanfordMoore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)分析。RNase由一條含124個(gè)氨基酸殘基多肽鏈組成，分子內(nèi)含有4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子量為12600。RNase是水解核糖核酸磷酸二酯鍵酶。7/1048/104

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定1、測(cè)定其分子量，拆開二硫鍵，確定肽鏈數(shù)目；2、氨基酸組成份析；3、肽鏈末端氨基酸測(cè)定4、專一性部分裂解；5、肽片段分離純化；6、各片段氨基酸次序測(cè)定；7、片段重合，拼出完整肽鏈氨基酸次序；8、確定二硫鍵和酰胺基位置。9/104

6.2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鏈主鏈不一樣肽段經(jīng)過本身相互作用、形成氫鍵，沿某一主軸盤旋折疊而形成局部空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包含：α-螺旋、

-折疊、

-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲10/1046.2.1多肽鏈折疊空間限制⑴肽平面(peptideplane)肽鍵形式上是單鍵,含有部分雙鍵性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)。肽鍵C及N周圍三個(gè)鍵角之和均為360°，使肽鍵四個(gè)原子和與之相連兩個(gè)

碳原子(C

)都處于同一個(gè)剛性平面－肽平面。11/104

肽鏈中只有α碳原子形成單鍵能夠旋轉(zhuǎn)，決定兩個(gè)肽鍵平面位置關(guān)系。肽鍵平面成為肽鏈盤波折疊基本單位。12/1046.2.2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本類型13/104⑴-螺旋結(jié)構(gòu)（

-helix）1950年P(guān)auling和Corey對(duì)α-角蛋白(α-keratin)進(jìn)行X線衍射分析，從衍射圖中看到有0.5～0.55nm重復(fù)單位，故推測(cè)蛋白質(zhì)分子中有重復(fù)性結(jié)構(gòu)，認(rèn)為這種重復(fù)性結(jié)構(gòu)為α-螺旋。天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手

-螺旋。

6.2.2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本類型14/104

蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是蛋白質(zhì)一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)其骨架：為N-C-C重復(fù)單位組成一條右旋肽鏈直徑：5?（0.5nm）螺圈：每3.6個(gè)氨基酸螺旋上升一圈螺距：5.4?（0.54nm)氨基酸間相距5.4?/3.6=1.5?（0.15nm），且沿中軸旋轉(zhuǎn)100o靠主鏈內(nèi)氫鍵維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

-螺旋中氨基酸側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響α-螺旋形成。15/104①多個(gè)肽平面經(jīng)過α-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互緊密盤曲成規(guī)則周期性構(gòu)象，即右手螺旋。②主鏈呈螺旋上升，每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，螺距0.54nm，每個(gè)Aa殘基沿軸上升0.15nm。16/10417/104

右手型α-螺旋18/104影響α-螺旋形成原因：酸性或堿性氨基酸集中區(qū)域，同電荷相斥;較大R(如Phe、Trp、Ile)集中區(qū)域;Pro亞氨基酸,不易形成氫鍵;Cα位于五元環(huán)上,不易扭轉(zhuǎn);GlyR基為H，空間占位很小，也會(huì)影響該處螺旋穩(wěn)定。19/104⑵

折疊結(jié)構(gòu)（

pleated）Astbury等人曾對(duì)β-角蛋白進(jìn)行X線衍射分析，發(fā)覺含有0.7nm重復(fù)單位。如將毛發(fā)α-角蛋白在濕熱條件下拉伸，可拉長(zhǎng)到原長(zhǎng)二倍，這種α-螺旋X線衍射圖可改變?yōu)榕cβ-角蛋白類似衍射圖。說明β-角蛋白中結(jié)構(gòu)和α-螺旋拉長(zhǎng)伸展后結(jié)構(gòu)相同。

20/104

折疊也稱β-片層（

pleatedsheet）

conformation)是由兩條或多條幾乎完全伸展多肽鏈側(cè)向經(jīng)過氫鍵連接在一起，相鄰兩肽鏈以相同或相反方向平行排列成片狀。21/104①肽鏈處于相當(dāng)伸展結(jié)構(gòu)，肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽鍵平面間呈110°角。每個(gè)Aa殘基伸展長(zhǎng)度為0.35，AA殘基R側(cè)鏈伸出在鋸齒上方或下方。②依靠?jī)蓷l肽鏈或一條肽鏈內(nèi)兩段肽鏈間C=O與另一條-NH基之間形成氫鍵，使構(gòu)象穩(wěn)定。③兩段肽鏈能夠是平行或是反平行。④平行β-片層結(jié)構(gòu)中，重復(fù)距離為0.65nm；反平行β-片層結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。β-片層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：22/104⑶

轉(zhuǎn)角（

turn）也稱

彎曲(

bend)、回折(reverseturn)。是指肽鏈出現(xiàn)180o回折，由彎曲處第一個(gè)AA殘基

-C=O與第四個(gè)AA殘基-NH間形成氫鍵(4

1氫鍵)

產(chǎn)生一個(gè)不很穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)。X－NH：O＝C(X＋3)23/10424/104⑷無規(guī)卷曲沒有確定規(guī)律性部分肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列,屬于渙散無規(guī)卷曲(randomcoil).25/104已知某分子量為240000蛋白質(zhì)多肽鏈一些節(jié)段是α-螺旋，而另一些節(jié)段是β-折疊，其分子長(zhǎng)度為5.06×10-5cm，求分子α-螺旋和β-折疊百分率。例題：26/104普通來講氨基酸殘基平均相對(duì)分子質(zhì)量為120，此蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為240000，所以氨基酸殘基數(shù)為240000/120=個(gè)。已知α-螺旋中，每個(gè)氨基酸殘基上升高度為0.15nm，β-折疊構(gòu)象中，每個(gè)氨基酸殘基上升高度為0.35nm，設(shè)此鏈中α-螺旋氨基酸殘基數(shù)為x，而β-折疊氨基酸殘基數(shù)為-x，則有：0.15x+0.35×(-x)=5.06×10-5×1070.15x+700-0.35x=506

求得x=970

所以α-螺旋占百分?jǐn)?shù)為：970÷×100%﹦48.5%則β-折疊百分率為51.5%。27/1046.2.3超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域都是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間一個(gè)層次。⑴超二級(jí)結(jié)構(gòu)(super-secondarystructure)超二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈內(nèi)次序上相互鄰近若干二級(jí)結(jié)構(gòu)單元常在空間折疊中靠近，相互作用形成規(guī)則結(jié)構(gòu)組合體(combination)，充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)件。28/104

由二段或三段右手

-螺旋彼此纏繞而成左手超螺旋(superhelix)，存在于

-角蛋白、肌球蛋白和纖維蛋白中。

由兩段或三段平行

折疊鏈（單股鏈）和一段連結(jié)鏈組成，連結(jié)鏈為

-螺旋或無規(guī)則卷曲。最常見

組合是由三段平行式

折疊鏈和二段

-螺旋鏈組成，稱為Rossmann折疊。

是由幾段平行

折疊鏈連結(jié)而成。己知超二級(jí)結(jié)構(gòu)有3種基本組合形式：29/10430/104⑵結(jié)構(gòu)域(domain)在較大球狀蛋白質(zhì)分子中，因?yàn)槎嚯逆溕舷噜彸?jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)絡(luò)，形成幾個(gè)緊密球狀構(gòu)象.彼此以渙散肽鏈相連球狀構(gòu)象。每個(gè)結(jié)構(gòu)域普通約由100-200個(gè)AA殘基組成，各有獨(dú)特構(gòu)象，并負(fù)擔(dān)不一樣生物學(xué)功效。結(jié)構(gòu)域是多肽鏈折疊單位，多肽鏈折疊最終一步是結(jié)構(gòu)域締合。31/104免疫球蛋白(IgG)由12個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中兩個(gè)輕鏈上各有2個(gè)，兩個(gè)重鏈上各有4個(gè)；補(bǔ)體結(jié)合部位與抗原結(jié)合部位處于不一樣結(jié)構(gòu)域。32/1046.2.4蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，經(jīng)過側(cè)鏈基團(tuán)相互作用，借助次級(jí)鍵維系，深入盤繞折疊形成含有一定規(guī)律三維空間結(jié)構(gòu).33/104穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是次級(jí)鍵:

氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、范德華力這些次級(jí)鍵存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)序號(hào)相隔很遠(yuǎn)氨基酸殘基R基團(tuán)之間，所以蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要指氨基酸殘基側(cè)鏈間結(jié)合。三級(jí)結(jié)構(gòu)是由多肽鏈AA次序決定。34/10435/104次級(jí)鍵都是非共價(jià)鍵,易受環(huán)境中pH、溫度、離子強(qiáng)度等影響，有變動(dòng)可能性。二硫鍵不屬于次級(jí)鍵，但在一些肽鏈中能使遠(yuǎn)隔二個(gè)肽段聯(lián)絡(luò)在一起，對(duì)于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上起著主要作用。36/104蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子主鏈折疊盤曲形成構(gòu)象基礎(chǔ)上，分子中各個(gè)側(cè)鏈所形成一定構(gòu)象.側(cè)鏈構(gòu)象主要是形成結(jié)構(gòu)域。球狀蛋白質(zhì)很多親水側(cè)鏈形成親水區(qū)，主要分布在蛋白質(zhì)分子表面；由疏水側(cè)鏈集中組成疏水區(qū)，多在分子內(nèi)部，疏水區(qū)常形成一些“洞穴”或“口袋”，一些輔基就鑲嵌其中,成為活性部位。37/1046.2.5蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)含有三級(jí)結(jié)構(gòu)幾條多肽鏈經(jīng)過次級(jí)鍵相互組合而形成特定構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)。(寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上相互關(guān)系或結(jié)合方式)。38/104亞基(subunit、單體)：四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中每一個(gè)含有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈稱為亞基(subunit)或亞單位、單體(monomer)。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指亞基立體排布、相互作用及接觸部位布局。亞基之間不含共價(jià)鍵，在一定條件下，四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可分離為其組成亞基，而亞基本身構(gòu)象仍可不變。亞基單獨(dú)存在時(shí)無生物活性，只有聚合成特定四級(jí)結(jié)構(gòu)才含有完整生物活性。39/104蛋白質(zhì)中亞基結(jié)構(gòu)可相同，也可不一樣。煙草斑紋病毒外殼蛋白是由2200個(gè)相同亞基形成多聚體；正常人血紅蛋白A是2個(gè)α亞基與2個(gè)β亞基形成四聚體。單體蛋白質(zhì)（monomerprotein）：無四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)稱單體蛋白，如：溶菌酶、肌紅蛋白等。寡聚蛋白質(zhì)（multimericprotein）：由兩個(gè)或多個(gè)亞基組成蛋白質(zhì)稱寡聚蛋白（多體蛋白），如：血紅蛋白。40/104原體（protomer）：寡聚蛋白質(zhì)中同等結(jié)組成份。如血紅蛋白是由兩個(gè)原體組成對(duì)稱二體，其中每個(gè)原體是由

亞基(一條

珠蛋白鏈)和

亞基(一條

珠蛋白鏈)所組成聚集體(

)。假如把原體看成單體，血紅蛋白為二體。假如亞基為單體，血紅蛋白則為四體。41/10442/104一些蛋白質(zhì)分子可深入聚合成聚合體(polymer)。聚合體中重復(fù)單位稱為亞基或單體(monomer)。聚合體可按其中所含單體數(shù)量不一樣而分為二聚體、三聚體……寡聚體(oligomer)和多聚體(polymer).胰島素(insulin)在體內(nèi)可形成二聚體及六聚體。43/104球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形成：多肽鏈主鏈?zhǔn)紫日郫B成一系列二級(jí)結(jié)構(gòu)，相鄰構(gòu)象單元隨即組合成規(guī)則超二級(jí)結(jié)構(gòu)，若干超二級(jí)結(jié)構(gòu)深入盤旋產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域形成含有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)亞基，若干亞基組裝成含有特定四級(jí)結(jié)構(gòu)寡聚體。

多肽鏈－二級(jí)結(jié)構(gòu)－超二級(jí)結(jié)構(gòu)－結(jié)構(gòu)域－亞基－寡聚體44/104氨基酸次序異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功效多樣性和種屬特異性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。一個(gè)由20種氨基酸組成20肽，有2×1018種次序異構(gòu)體。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，特定構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團(tuán)形成次級(jí)鍵來維持，蛋白質(zhì)多肽鏈在體內(nèi)被合成后，可依據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)自然折疊和盤曲，形成一定構(gòu)象。

7.1蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功效關(guān)系7蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系45/104一級(jí)結(jié)構(gòu)相同蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象及功效也相同。胰島素分子中氨基酸殘基差異部分

46/104同源蛋白質(zhì)(homologousprotein)種屬差異與生物進(jìn)化

同源蛋白質(zhì)氨基酸次序中有許多位置氨基酸對(duì)全部種屬是相同，被稱為不變殘基(invariantresidue);而其它位置氨基酸對(duì)不一樣種屬卻有相當(dāng)大改變，則被稱為可變殘基(variableresidue)；同源蛋白質(zhì)氨基酸次序中這么相同性稱為次序同源(sequencehomology)。7.1.1一級(jí)結(jié)構(gòu)種屬差異與分子進(jìn)化同源蛋白質(zhì)是指在不一樣有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功效蛋白質(zhì)。47/104不一樣種屬起源細(xì)胞色素c(cytochromec)中，能夠變換氨基酸殘基數(shù)目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上位置有親密關(guān)系。在進(jìn)化位置上相距愈遠(yuǎn),則氨基酸次序之間差異愈大。48/104CytC分子中Aa殘基差異數(shù)目及分歧時(shí)間

49/1047.1.2一級(jí)結(jié)構(gòu)變異與分子病在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，參加功效活性部位AA殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位AA殘基，即使在整個(gè)分子中發(fā)生一個(gè)殘基異常，該蛋白質(zhì)功效也會(huì)受到顯著影響。鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血被稱之為“分子病”,僅僅是因?yàn)?74個(gè)AA殘基中，1個(gè)AA殘基改變?cè)斐伞?/p>

50/10451/104血紅蛋白β亞基N端第6號(hào)氨基酸殘基發(fā)生了變異，它變異起源于基因上遺傳信息突變。52/104核糖核酸酶S有124個(gè)AA殘基,多肽鏈中有4對(duì)S-S維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)，用大量巰基乙醇和適量尿素還原4對(duì)S-S，酶活力全部喪失。若將尿素和巰基乙醇除去,在有氧條件下使S-S遲緩氧化成二硫鍵，酶活力水平可靠近于天然酶。蛋白質(zhì)功效取決于特定天然構(gòu)象,決定構(gòu)象所需信息包含在其AA序列中。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)可自動(dòng)地發(fā)展到二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。7.2蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系1.以核糖核酸酶S為例來說明構(gòu)象與功效關(guān)系53/10454/1042.以肌紅蛋白和血紅蛋白為例說明蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功效關(guān)系肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白(Hb)結(jié)構(gòu)相同性決定了功效相同性。肌紅蛋白與血紅蛋白都能與氧結(jié)合，因?yàn)樗鼈円匝t素為輔基，而且在血紅素周圍以疏水性氨基酸殘基為主，形成空穴，為鐵原子與氧結(jié)合創(chuàng)造了結(jié)構(gòu)環(huán)境。肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白(Hb)結(jié)構(gòu)差異性決定了功效不一樣；肌紅蛋白為單肽鏈蛋白質(zhì)，而血紅蛋白是由四個(gè)亞基組成寡聚蛋白，這么空間結(jié)構(gòu)差異決定了它們之間功效各自特征。55/10456/104肌紅蛋白主要功效是儲(chǔ)存氧。其三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊方式使輔基血紅素對(duì)環(huán)境中O2濃度改變非常敏感，當(dāng)環(huán)境中O2分壓高時(shí)，Mb與O2結(jié)合能力極高，起到對(duì)O2儲(chǔ)存功效；當(dāng)環(huán)境中O2分壓低時(shí)，Mb與O2結(jié)合能力大大降低，對(duì)外釋放O2，為環(huán)境提供O2供機(jī)體所需。血紅蛋白主要功能是在循環(huán)中轉(zhuǎn)運(yùn)氧。Hb由4個(gè)亞基組成四級(jí)結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基可結(jié)合1個(gè)血紅素并攜帶1分子氧，共結(jié)合4分子氧。Hb各亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)與Mb極為相同，也有可逆結(jié)合氧分子能力，但Hb各亞基與氧結(jié)合存在著正協(xié)同效應(yīng)。57/104血紅蛋白構(gòu)象改變與運(yùn)氧功效變構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect）：當(dāng)血紅蛋白一個(gè)α亞基與氧分子結(jié)合以后，可引發(fā)其它亞基構(gòu)象發(fā)生改變，對(duì)氧親和力增加，從而造成整個(gè)分子氧結(jié)協(xié)力快速增高，使血紅蛋白氧飽和曲線呈“S”形(圖2-11)。這種因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子構(gòu)象改變而造成蛋白質(zhì)分子功效發(fā)生改變現(xiàn)象稱為變構(gòu)效應(yīng)。引發(fā)變構(gòu)效應(yīng)小分子稱變構(gòu)效應(yīng)劑。變構(gòu)效應(yīng)在細(xì)胞蛋白與酶功效調(diào)整中有普遍意義。協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)：一個(gè)亞基與其配體（Hb中配體為O2）結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一亞基與配體結(jié)合能力，稱為協(xié)同效應(yīng)。假如是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)（positivecooperativity）；反之則為負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativity）。58/104蛋白構(gòu)象疾?。哄e(cuò)誤構(gòu)象相互聚集，形成抗蛋白水解酶淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病。老年癡呆瘋牛病亨汀頓舞蹈病59/104（二級(jí)結(jié)構(gòu)及其它改變）正常動(dòng)物PrPc

（二級(jí)結(jié)構(gòu)多為α螺旋、對(duì)蛋白酶敏感、水溶性）致病蛋白PrPsc（一級(jí)結(jié)構(gòu)相同，但二級(jí)結(jié)構(gòu)全為β折疊，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉樣沉淀）未知蛋白60/104正常蛋白PrPc和可致瘋牛病蛋白PrPsc一級(jí)結(jié)構(gòu)相同，只存在空間構(gòu)象差異61/1048.蛋白質(zhì)主要性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成大分子化合物，其部分理化性質(zhì)與氨基酸相同：

兩性電離、等電點(diǎn)、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)；蛋白質(zhì)同時(shí)又含有膠體性和變性與復(fù)性等性質(zhì)。62/1048.1蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和測(cè)定方法蛋白相對(duì)分子質(zhì)量普通在104-106.其相對(duì)分子質(zhì)量可依據(jù)其化學(xué)組成測(cè)定或者利用蛋白質(zhì)一些理化性質(zhì)來測(cè)定.63/104①沉降速度法將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機(jī)中進(jìn)行超速離心。因?yàn)槌鲋亓资f倍離心力作用，而使蛋白質(zhì)分子沉降下來。大小和形狀都相同蛋白質(zhì)分子下沉速度相同，在離心管中產(chǎn)生一個(gè)顯著界面，利用光學(xué)系統(tǒng)能夠觀察到此界面移動(dòng)，從而測(cè)得蛋白沉降速度。一個(gè)顆粒在單位離心力場(chǎng)中沉降速率為恒定值,稱為沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient),用s表示.

64/104②凝膠過濾法在層析柱中裝入葡聚糖凝膠顆粒。這種凝膠顆粒含有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)孔只允許較小分子進(jìn)入顆粒內(nèi)，而大于網(wǎng)孔分子則被排阻。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí)，被排阻相對(duì)分子質(zhì)量大分子先被洗脫下來,相對(duì)分子質(zhì)量小分子后下來。65/10466/10467/104③SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳速度，決定于蛋白分子大小,形狀和電荷數(shù)量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳速度，則決定于蛋白質(zhì)分子大小。SDS(十二烷基硫酸鈉)是一個(gè)去垢劑,可與蛋白質(zhì)結(jié)合,使其變性并帶上大量負(fù)電荷，解離成亞基，同時(shí)變成棒狀,從而掩蓋了蛋白質(zhì)原有電荷和形狀差異.蛋白質(zhì)電泳速度只決定于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小.68/104LPA重組蛋白純化及Western-blot檢測(cè)

1

2

3

41:LPA包涵體重組蛋白表示產(chǎn)物2:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白

3:對(duì)照4:純化后蛋白27.1kDa1:LPA重組蛋白

Western-blot檢測(cè)

69/104SDS-凝膠電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。用幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)對(duì)對(duì)應(yīng)相對(duì)遷移率作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)測(cè)得樣品相對(duì)遷移率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上能夠查出樣品相對(duì)分子質(zhì)量.70/10471/1048.2蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子量很大，普通在10000-1000000之間，在水溶液中分子直徑在1-100nm之間，含有膠體溶液性質(zhì)，如不能經(jīng)過半透膜、有電泳現(xiàn)象等。所以可用透析和電泳方法來分離、純化蛋白質(zhì)。72/104維特蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性原因水化層：球狀蛋白質(zhì)表面多親水基團(tuán)(-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）,含有強(qiáng)烈地吸引水分子作用,在水溶液中蛋白質(zhì)顆粒表面形成一層很厚水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒相互聚集。同性電荷:在非等電點(diǎn)時(shí)蛋白顆粒帶有同性電荷,相互排斥。

73/104蛋白質(zhì)含有許多游離氨基,羧基,咪唑基,胍基,巰基、酚基等,所以與AA一樣，也是兩性電解質(zhì)。當(dāng)溶液在某一pH值時(shí),蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等,凈電荷為零,此時(shí)溶液pH稱該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI。8.3蛋白質(zhì)兩性電離及等電點(diǎn)74/10475/104蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí),因沒有同性電荷排斥,最不穩(wěn)定，溶解度最小,極易借靜電引力結(jié)合成較在聚集體沉淀出來（分離提純蛋白質(zhì)方法）。電泳:帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向電荷相反電極泳動(dòng)現(xiàn)象。電泳方法是試驗(yàn)室、生產(chǎn)、臨床診療等慣用來分離蛋白質(zhì)和判定蛋白質(zhì)純度伎倆。

76/1048.4蛋白質(zhì)變性作用天然蛋白質(zhì)因受物理及化學(xué)原因影響，使其分子原有天然構(gòu)象發(fā)生改變（次級(jí)鍵破壞）,造成理化性質(zhì)和生物活性發(fā)生改變,稱為變性(denaturation)。變性蛋白質(zhì)只有空間構(gòu)象破壞，蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級(jí)鍵，二硫鍵破壞，并不包括一級(jí)結(jié)構(gòu)改變。77/104蛋白質(zhì)變性與復(fù)性去除部分變性劑溫和復(fù)性溫和復(fù)性天然蛋白（含有正確一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，所以含有生物活性）變性蛋白（含有正確一級(jí)結(jié)構(gòu)但無高級(jí)結(jié)構(gòu)，無生物活性）變性環(huán)境非天然蛋白（含有正確一級(jí)結(jié)構(gòu)和錯(cuò)誤高級(jí)結(jié)構(gòu)，無生物活性）【經(jīng)典舉例】Rnase78/104引發(fā)蛋白質(zhì)發(fā)生變性原因化學(xué)原因：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、苦味酸、濃乙醇等。物理原因：加熱(70-100℃)、加壓、脫水、猛烈振蕩或攪拌,紫外線,X-射線照射,超聲波,高壓處理等。變性原因常被應(yīng)用于消毒及滅菌；保留蛋白質(zhì)制劑時(shí)應(yīng)注意預(yù)防蛋白質(zhì)變性。79/104①生物活性喪失；②包藏在分子內(nèi)部側(cè)鏈基團(tuán)暴露；③理化性質(zhì)改變:變性后疏水基外露,溶解度降低形成沉淀。但在堿性溶液中或有變性劑存在時(shí)不沉淀，除去變性劑后則沉淀。球狀蛋白質(zhì)在變性后，分子伸展不對(duì)稱程度增加，粘度加大，擴(kuò)散系數(shù)降低；④生化性質(zhì)改變:蛋白質(zhì)變性后分子結(jié)構(gòu)伸展渙散，所以變性蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)更易受蛋白酶作用，這就是熟食易于消化道理。變性蛋白質(zhì)特點(diǎn)：80/104復(fù)性(renaturation)：當(dāng)變性原因去除后，有些變性蛋白質(zhì)又可遲緩重新回復(fù)到天然構(gòu)象。核糖核酸酶S在β-巰基乙醇和8M尿素作用下發(fā)生變性，經(jīng)過透析去除尿素和β-巰基乙醇，酶蛋白又可恢復(fù)其原來構(gòu)象，生物學(xué)活性也幾乎全部恢復(fù)。許多蛋白質(zhì)變性時(shí)被破壞嚴(yán)重，天然構(gòu)象不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性。

81/1048.5蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)破壞蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)凝聚成大質(zhì)點(diǎn),而從溶液中析出現(xiàn)象,稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)。穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水膠體原因是顆粒表面水化層和電荷。若除掉這兩個(gè)穩(wěn)定原因（如調(diào)整溶液pH至等電點(diǎn)和加入脫水劑），蛋白質(zhì)便輕易凝集析出。高濃度中性鹽、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑等都可引發(fā)蛋白質(zhì)沉淀。82/104①中性鹽加入高濃度中性鹽（[NH4]2SO4,Na2SO3,NaCl等），可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒水化層,同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)電荷,使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出現(xiàn)象稱為鹽析(saltingout).鹽析法是最慣用分離蛋白質(zhì)方法。83/104鹽溶（saltingin）：低濃度中性鹽可增加蛋白質(zhì)溶解度。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子吸附一些鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子相互排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子相互作用加強(qiáng)，所以溶解度提升。鹽析（saltingout）：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性而使其析出。鹽溶與鹽析84/104加入大量中性鹽,使水活度降低,原來溶液中大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子水化水,從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間相互作用,破壞了蛋白質(zhì)分子表面水化層,同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)電荷,使蛋白質(zhì)沉淀.85/104慣用中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需鹽濃度及pH不一樣，故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分分離。用半飽和硫酸銨來沉淀出血清中球蛋白，飽和硫酸銨能夠使血清中白蛋白,球蛋白都沉淀出來.鹽析沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍確保蛋白質(zhì)活性?？烧{(diào)整蛋白質(zhì)溶液pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀效果更加好。86/104②有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)可與水混合有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對(duì)水親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒水化膜，使蛋白質(zhì)顆粒輕易凝集而沉淀。調(diào)整蛋白質(zhì)溶液至等電點(diǎn)時(shí)，加入有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)沉淀。常溫下有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引發(fā)變性。在低溫條件下,則變性進(jìn)行較遲緩,可用于分離制備蛋白質(zhì).87/104③重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)當(dāng)溶液pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀蛋白質(zhì)常是變性，誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合重金屬鹽嘔吐出來解毒。若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性蛋白質(zhì)。88/104④生物堿試劑和一些酸類沉淀蛋白質(zhì)pH<pI時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷,易與帶負(fù)電(酸根陰離子)生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及一些酸(如三氯醋酸,過氯酸,硝酸)生成不溶性鹽而沉淀.血液化學(xué)分析時(shí)常利用此原理除去血液中蛋白質(zhì),這類沉淀反應(yīng)也可用于檢驗(yàn)?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。89/104⑤加熱凝固(coagulation)

將靠近于等電點(diǎn)蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉淀。加熱使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則肽鏈結(jié)構(gòu)被打開呈渙散狀不規(guī)則結(jié)構(gòu)，分子不對(duì)稱性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀蛋白塊。煮熟雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。90/104蛋白質(zhì)變性,沉淀,凝固相互之間有很親密關(guān)系。但蛋白質(zhì)變性后并不一定沉淀,變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀,沉淀變性蛋白質(zhì)也不一定凝固.蛋白質(zhì)被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿變性后因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒帶著大量電荷，故仍可溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿之中。但若將強(qiáng)堿和強(qiáng)酸溶液pH調(diào)整到等電點(diǎn)，則變性蛋白質(zhì)凝集成絮狀沉淀物,若將此絮狀物加熱,則分子間相互盤纏而變成較為堅(jiān)固凝塊。91/1048.6蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)

①茚三酮反應(yīng)②雙縮脲反應(yīng)③米倫反應(yīng)④蛋白質(zhì)黃色反應(yīng)⑤Folin-酚反應(yīng)⑥醋酸鉛反應(yīng)⑦坂口反應(yīng)

⑧乙醛酸反應(yīng)92/104

①茚三酮反應(yīng)

氨基酸脫羧脫氨被氧化，水合茚三酮被還原，氧化型和還原型水合茚三酮與氨反應(yīng)生成二酮茚-二酮茚胺取代鹽等藍(lán)紫色化合物。

脯氨酸(Pro)或羥脯氨酸(Hyp)與茚三酮反應(yīng)，生成黃色化合物。慣用于AA定性和定量分析。93/104(2)雙縮脲反應(yīng)(BiuretReaction)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用展現(xiàn)紫紅色(在540nm有最大光吸收峰),稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個(gè)以上-CO-NH-鍵化合物都呈此反應(yīng),蛋白質(zhì)分子中氨基酸是以肽鍵相連,所以,全部蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。(3)米倫反應(yīng)(MillonReaction)蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試