馬尾松、黑松、鋼的誘抗試驗(yàn)

馬尾松、黑松、鋼的誘抗試驗(yàn)

植物被病物入侵后，其防護(hù)機(jī)制被中斷或破壞，無法避免病物入侵。通常，植物可以人為地刺激植物，促進(jìn)植物在再次感染病原體后的不同抵抗能力。這就是植物的誘導(dǎo)抗性。誘導(dǎo)抗性在植物和病害種類上的發(fā)生都很廣泛。外源激素和鈣能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)酶系統(tǒng)的變化和含量及其活性的變化,并能提高植物的抗病能力;水楊酸和銨能結(jié)合蛋白、氨基酸和參與酶的合成,并能誘導(dǎo)或直接起到抑制菌和線蟲的繁殖,從而提高植物的抗病性。本試驗(yàn)旨在通過運(yùn)用較系統(tǒng)的激素、鈣、水楊酸和銨及它們的混合配方,對松樹抗松材線蟲病的誘抗試驗(yàn),尋找出一種能誘導(dǎo)松樹產(chǎn)生抗松材線蟲病的物質(zhì)或配方,以便填補(bǔ)松樹對松材線蟲病的誘導(dǎo)抗性理論和實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)松(1)種子種苗al.a馬尾松(PinusmassonianaL.),系從種源產(chǎn)地引進(jìn)的種子,育苗,2a生;黑松(P.ThunbergiiParl.),系種子育苗,4a生。(2)松弛為江蘇省林科院種源試驗(yàn)林內(nèi)的馬尾松和黑松,15a生。供試松苗、松樹為每處理4株,重復(fù)3次。1.2nh3-硝酸銨試驗(yàn)(1)激素:乙烯利(C2H4),吲哚乙酸(IAA),吲哚丁酸(IBA),赤霉素(GA3),萘乙酸(NAA),6-芐基氨基嘌呤(BA),玉米素(KT)和脫落酸(ABA)。(2)鈣(Ca2+):碳酸鈣(CaCO3),氯化鈣(CaCl2·2H2O)。(3)水楊酸(Sa)。(4)銨(NH+4):磷酸二氫銨(NH4)H2PO4(APM),硝酸鉀(KNO3)(PN),尿素[CO(NH2)2](UR),硝酸銨NH4NO3(AN)。(5)誘抗方法①稀釋方法:激素的配置是根據(jù)其理化性質(zhì),將BA和KT用酸溶解,其余生長素均用乙醇溶解后配成所需試驗(yàn)濃度;水楊酸用雙氧水溶解一定量的水楊酸,并用1NNaOH調(diào)pH至6.8,配成1mol/L(1M/L=138.12g138.12MW)1mol/L(1Μ/L=138.12g138.12ΜW)后,稀釋所需試驗(yàn)濃度;鈣和銨先用蒸餾水配成母液后,再用水稀釋至所需試驗(yàn)濃度。凡兩種物質(zhì)混用時(shí)均在原使用濃度的基礎(chǔ)上各減半后再混配試驗(yàn)。②施用方法:a噴霧法:將配成所需濃度的噴施液均勻地噴布于松苗枝葉面上,噴潮后,再噴1次,至滴水為止;噴2次試驗(yàn)是在噴第1次后隔1周再噴1次。b注干法:用手搖木鉆,沿45°角,打一直徑為1cm的小孔(孔口高,孔底低,孔深4～5cm),注銨后,孔口塞一棉球,并用膠帶封口,以防銨(NH+4)揮發(fā),3d后另打一孔接種線蟲。③銨對線蟲影響的培養(yǎng)方法:把銨(NH+4)配成所需濃度待PDA培養(yǎng)基上灰葡萄孢(Botrytiscinerea)長滿,將銨(NH+4)和線蟲(100條/皿)同時(shí)接入皿內(nèi)培養(yǎng),每處理每次檢查3個(gè)培養(yǎng)皿,每隔2d定期檢查其線蟲在不同銨(NH+4)含量培養(yǎng)下的繁殖增殖數(shù)量。1.3灰葡萄孢培養(yǎng)繁殖松材線蟲是從近期死亡的病死木分離而得,并經(jīng)PDA平板上的灰葡萄孢培養(yǎng)繁殖。接種方法是松苗采用“截枝套管法”和松樹采用“樹干打孔法”,接種線蟲量松苗為1000條/株,松樹為5000條/株。1.4指數(shù)ip感病癥狀進(jìn)程觀察按文獻(xiàn)的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,并計(jì)其感病指數(shù)(IP)。誘抗效果是以感病指數(shù)下降百分率表示,誘抗效果(%)=對照IP?處理IP對照IP×100(%)=對照ΙΡ-處理ΙΡ對照ΙΡ×100。2結(jié)果和分析2.1不同激素、鈣、銨和水楊酸噴霧劑對松苗松病的誘導(dǎo)抗劑效果2.1.1激素對馬尾松苗的誘抗效果于1996年8月3日噴施激素后,接種線蟲,并于8月10日至11月25日噴施第2次,每3d觀察1次,試驗(yàn)結(jié)果表明,激素處理馬尾松苗后,均有不同程度的誘抗效果,其中以IBA、C2H4(噴2次)和IBA+C2H4(噴2次)處理的效果最好,達(dá)60%,其他處理也有些效果,說明激素處理馬尾松苗對松材線蟲病有一定的誘抗效果(見表1)。2.1.2激素噴霧處理對黑松苗線蟲病的誘導(dǎo)效果處理和觀察時(shí)間、方法同上(2.1.1)。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同激素噴霧處理后對黑松苗抗松材線蟲病的誘導(dǎo)效果,除IBA+C2H4配方處理的誘導(dǎo)抗性效果為12.5%外,其余均無效(見表2)。說明激素對黑松苗的誘導(dǎo)抗性是不可行的。2.1.3ca2+、激素及其混合使用對黑松苗抗松材線蟲病的效果影響本試驗(yàn)是在1996年8月3日噴施后,8月6日接種線蟲,處理第2次組于8月10日再噴施1次,至12月18日檢查的試驗(yàn)結(jié)果表明,Ca2+、激素及其混合使用后對黑松苗誘抗松材線蟲病的效果比單用激素處理(表2)組要略提高些,其中Ca2++IBA和Ca2+處理,誘抗效果最為明顯,達(dá)36.67%和33.33%等,其他處理如Ca2++GA3、Ca2++NAA和KT+IAA等處理也有一定的誘抗效果(見表3),說明Ca2+或Ca2+加激素的混合使用能誘導(dǎo)和提高黑松苗抗松材線蟲病的能力。2.1.4硝酸銨誘抗效果本試驗(yàn)是1997年6月1日噴施處理后6月4日接種線蟲,第2次處理于6月8日再噴施1次,至11月20日檢查試驗(yàn)結(jié)果表明,硝酸銨(1次),Ca2+(2次)、Ca2++IBA(2次)和IBA+Sa(1次)的誘抗效果分別為16.67%,14.0%,16.0%和16.67%,其他處理均無效(見表4)。試驗(yàn)說明水楊酸噴霧處理黑松苗對松材線蟲病無誘導(dǎo)抗性效果和應(yīng)用前景。2.2不同激素、鈣、銨和水楊酸的注入處理了松樹對松竹線昆蟲疾病的誘導(dǎo)抗劑2.2.1sa+ca2+處理誘導(dǎo)效果本試驗(yàn)于1997年6月18日進(jìn)行注干處理,6月20日接種松材線蟲,至9月20日檢查的試驗(yàn)結(jié)果表明,除Sa+Ca2+處理有20%的誘抗效果外,其余各處理均無誘抗效果。繼續(xù)觀察Sa+Ca2+處理組至10月16日,該處理也達(dá)100%死亡(見表5)。試驗(yàn)說明不同激素、鈣、銨和水楊酸及其混用處理黑松樹無誘導(dǎo)抗松材線蟲病的效果。2.2.2銨處理對馬尾松灰葡萄孢的誘抗效果本試驗(yàn)于1996年8月5日進(jìn)行注銨處理,8月8日接種松材線蟲,至11月19日檢查的試驗(yàn)結(jié)果表明,除CaCl2·2H2O處理無誘抗效果外,其余各處理均有較高的誘導(dǎo)抗病效果,其中磷酸二氫銨+硝酸鉀、磷酸二氫銨和硝酸銨3個(gè)處理效果最好,分別為100%,83.33%和83.33%,其余4組處理均為66.68%。由于供試馬尾松種源樹本身的抗病評價(jià)(人工接種松材線蟲的試驗(yàn))的感病指數(shù)是在40～60之間,屬中抗種源(見表6)。經(jīng)注銨后,樹體內(nèi)銨抑制了松材線蟲的繁殖(見圖1),不同濃度銨和線蟲同時(shí)接在葡萄孢上培養(yǎng)觀察松材線蟲的增殖趨勢,也說明銨能有效地抑制松材線蟲的繁殖,培養(yǎng)2周后,繁殖線蟲量最少的磷酸二氫銨、硝酸銨和硝酸鉀平均每皿分別是233條、250條和600條,分別是對照(灰葡萄孢培養(yǎng))的7.1%,7.6%和18.2%(見圖1),說明銨處理馬尾松有較高的誘抗效果(見表6)。也就是說,中抗馬尾松用銨處理后,是可以提高對松材線蟲病的抗病能力的。3討論3.1信號刺激與基因表達(dá)(1)從參與植物抗病防衛(wèi)的過程來看,這些基因的表達(dá)調(diào)控都具有4方面特征:a為特定信號誘導(dǎo)而表達(dá),信號刺激與基因表達(dá)之間常需要第二信使的作用;b基因表達(dá)具有組織、器官的特異性;c表達(dá)的次序有先有后;d基因的時(shí)空表達(dá)決定植物抵抗病原物侵染的有效性。(2)基因有功能分區(qū)、上游序列的3種順式元件各負(fù)其職:激應(yīng)性元件(RE)負(fù)責(zé)接收信號,啟動子驅(qū)動結(jié)構(gòu)基因表達(dá),增強(qiáng)子加強(qiáng)信號反應(yīng)和基因表達(dá)的程度。(3)信號刺激與RE對信號的接收之間,一般都要有第二信使的作用。已報(bào)道的第二信使有水楊酸、H2O2、乙烯、Ca2+等,除了水楊酸在煙草抗病毒誘導(dǎo)中的功能得到公認(rèn),其他幾種物質(zhì)的作用有待真正確定。本試驗(yàn)的第二信使實(shí)驗(yàn)有一定的誘抗效果,但不同植物、不同病原物和不同第二信使物及它們的不同組合的實(shí)驗(yàn)仍需作大量工作,方可選出最為合適的第二信使來誘導(dǎo)植物的抗病性。3.2抗誘導(dǎo)效應(yīng)的評價(jià)3.2.1多酚氧化酶he的合成據(jù)報(bào)道,激素能促進(jìn)植物的系統(tǒng)變化,例如乙烯氣體對過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的效應(yīng),及其在專化性抗真菌化合物合成上的作用,過氧化物酶是利用在氧化反應(yīng)(也含乙烯的合成)中釋放出H2O2來保護(hù)細(xì)胞免于損傷;多酚氧化酶系通過下列途徑在抗病性中起作用,即將酚類化合物氧化為酚酸,而酚酸又進(jìn)一步氧化成為有毒的抗真菌的醌類等多種激素而起類似功用。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)就是建立在此基礎(chǔ)上的。激素的誘抗試驗(yàn)證明其誘抗性是有一定范圍的,只有在(植物)馬尾松苗本身有一定的抗病性的基礎(chǔ)上,再用激素誘抗才可取得一定的誘抗效果,效果最明顯的處理IBA、乙烯和IBA+乙烯,可達(dá)60%,而對敏感松黑松苗的誘抗試驗(yàn)除IBA+乙烯配方處理的誘抗效果為12.5%外,其余各處理均無效。3.2.2蛋白不可缺少的結(jié)合和調(diào)節(jié)組分已有許多文獻(xiàn)報(bào)道鈣處理能提高植物組織和細(xì)胞組織的多種抗逆性。Ca2+是許多活性蛋白不可缺少的結(jié)合和調(diào)節(jié)組分,是一種廣泛存在的第二信使。通過Ca2+處理和Ca2+與激素的混配處理能較明顯地提高敏感松黑松對松材線蟲病的誘抗能力,并比單用激素處理誘抗效果高,其中誘抗效果最高的是Ca2++IBA配方處理,達(dá)36.67%。3.2.3對黑松苗的誘導(dǎo)效果據(jù)報(bào)道,水楊酸及其鹽類是廣泛存在于植物中的酚類物質(zhì)。Sa外源處理可誘導(dǎo)農(nóng)作物產(chǎn)生對真菌、細(xì)菌、病毒等引起病害的局部和系統(tǒng)性抗性,有關(guān)報(bào)道很多。本試驗(yàn)認(rèn)為水楊酸處理黑松苗對松材線蟲病的誘抗效果不明顯,只有Sa+IBA配方處理的誘抗效果僅為16.7%。其余(包括Sa單用或混用)均無誘抗效果。3.2.4銨離子檢測化合物的作用銨的作用有3個(gè),一是以NH+4態(tài)N和NO-3態(tài)N的形式被植物吸收,氮素能增加和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素、生長素的含量和活性,降低ABA的含量。提高植物的生長發(fā)育和代謝作用。二是作為金屬絡(luò)合作用的配位體,完善蛋白質(zhì)的構(gòu)象和參與肽鍵的形成,被解毒轉(zhuǎn)化為氨基酸等。三是銨離子能直接抑制線蟲孵化,起防治線蟲作用等。另外,Trolldenier認(rèn)為在較高的氮素營養(yǎng)下,即使根部傷害較多,但根的更新速度要比病菌感染的速度快,能使小麥增產(chǎn)34%等。本