(修改)實(shí)驗(yàn)四-Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳課件

實(shí)驗(yàn)四電泳技術(shù)

Hb醋酸纖維薄膜堿性電泳

與

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)四電泳技術(shù)

Hb醋酸纖維薄膜堿性電泳

與

血背景知識(shí)電泳：指帶電膠體粒子或分子在電場的作用下，作定向移動(dòng)。由于各種物質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同、分子量、分子結(jié)構(gòu)不同，形狀大小各有差異，所以在同一PＨ環(huán)境中所帶的電荷量各有不同，因此在同一電場中泳動(dòng)速度也就不同。一般來說，所帶的電荷多而分子量、形狀小者，泳動(dòng)速度快，反之則慢。背景知識(shí)電泳：指帶電膠體粒子或分子在電場的作用下，作定向移動(dòng)電泳技術(shù)的分類：目前主要?dú)w納為；

1）顯微電泳——即在顯微鏡下觀察膠體粒子或細(xì)胞的移動(dòng)度，也稱細(xì)胞電泳。2）自由電泳——即懸浮在介質(zhì)中的細(xì)胞和生物大分子，在有電場作用下自由定向移動(dòng)。電泳技術(shù)的分類：目前主要?dú)w納為；

1）顯微電泳—3）區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支持物上進(jìn)行直接分離，鑒定生物物質(zhì)，促使獲得各自電荷差異的生物粒子或分子形成各自區(qū)域以帯形停留在載體上。如：濾紙、淀粉、瓊脂、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等，此類電泳技術(shù)分離技巧簡便，運(yùn)用十分廣泛。

4）免疫電泳：即抗原與抗體在比例合適的瓊脂糖載體中相結(jié)合的一種電免疫技術(shù)，親和電泳即屬此類。

。3）區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支根據(jù)緩沖液的性質(zhì)不同可分為：1.連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液的離子成分、PH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液相同，帶電顆粒電泳時(shí)僅具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

2.不連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液離子成分、pH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液不盡相同，帶電顆粒電泳時(shí)具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。根據(jù)緩沖液的性質(zhì)不同可分為：1.連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液的離子成Hb醋酸纖維薄膜堿性電泳

一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（ExperimentalObjectives）：

1.掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作2.了解血紅蛋白的組成及分類Hb醋酸纖維薄膜堿性電泳

一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

血紅蛋白（Hb)的組成及分類：血紅蛋白（Hb)：由亞鐵血紅素、珠蛋白組成。每個(gè)珠蛋白分子由4條多肽鏈構(gòu)成，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的不同可分為α、β、γ、δ四種類型。

正常成人Hb種類：

組成百分含量pIHbAα2β295~98%6.95HbA2α2δ22~3%7.38HbFα2γ2<1%>6.95血紅蛋白（Hb)的組成及分類：二、實(shí)驗(yàn)原理

(ExperimentalPrinciples)在PH8.6的環(huán)境中，Hb是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（Hb的pI〈

8.6）

，因此，與醋酸纖維薄膜作支持物，在電場中Hb向陽極泳動(dòng)。電泳時(shí)，由于各種Hb所帶電荷的不同，造成各自的泳動(dòng)速度不同，因而被分離。這種分離可初步鑒定不同的Hb。二、實(shí)驗(yàn)原理

(ExperimentalPrinc醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙?；蠖瞥傻?，浸濕后有巨大的張力和柔韌性，幾乎對所有生物活性物質(zhì)均能通過電泳作用得到分離。醋酸纖維素薄膜電泳因設(shè)備簡單、操作方便、電泳時(shí)間短、分辨率高、區(qū)帶分離清晰、無拖尾、易定量等，已成為臨床、實(shí)驗(yàn)室首選的方法。醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙?；蠖瞥傻模窈笥腥?、操作步驟（OperatingProcedure）1.取血：用碘伏及75%酒精棉球消毒手指尖，采血針穿刺,取血約0.05ml放入1.5mlEP管中，并輕輕搖勻。2.制備Hb液：1）洗滌紅細(xì)胞：加0.9%NaCl1ml于上述管中，顛倒混勻5-6次，3000rpm/分，離心3分鐘，棄上清液。重復(fù)以上操作一次。2）溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水2滴，搖勻，再加入CCl42滴，充分搖勻，4000rpm/分，離心3分鐘,取上清液備用。三、操作步驟（OperatingProcedure）1.取3.電泳1）膜條準(zhǔn)備：提前2小時(shí)把膜條浸泡在浸膜緩沖液中待用。2）點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在濾紙上（毛面朝上），用小玻片沾取適量Hb液，按印于點(diǎn)樣線上。3.電泳3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條點(diǎn)樣面向下，光滑面向上。點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極。用浸泡在緩沖液中的紗布分別蓋住膜條的兩端，使膜條兩端與緩沖液相連。蓋嚴(yán)電泳室，通電，平衡5-10分鐘，調(diào)節(jié)電壓為100V，電泳30分鐘。4）染色：電泳完畢后將膜條取下并放在麗春紅染色液中浸泡10分鐘。4.漂洗：將膜條從染色液中取出后放至漂洗液中漂洗2-3次，使背景為白色即可，這樣就得到清晰的電泳圖譜。3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，將膜條平懸于電泳醋酸纖維素薄膜堿性電泳，正常情況下可分離出4條區(qū)帶。它們分別是：（+）→（-）HbA→HbA2→CAⅠ→CAⅡ四、結(jié)果與分析：

（ResultsandAnalysis）醋酸纖維素薄膜堿性電泳，正常情況下可分離出4條區(qū)帶。它們分別觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深淺。觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深淺。五、思考題：(Questions)電泳分離蛋白質(zhì)的原理是什么？五、思考題：(Questions)*臨床意義血紅蛋白?。褐钢榈鞍纂逆溄Y(jié)構(gòu)發(fā)生異變。異常血紅蛋白：指珠蛋白鏈中一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被置換、缺失或增加，造成血紅蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常，導(dǎo)致一系列病理和生理改變。

人類異常血紅蛋白高達(dá)兩千多種類型，約300人中即有一人是異常血紅蛋白攜帶者。因此，在臨床上快速、早期診斷尤為重要。*臨床意義血紅蛋白?。褐钢榈鞍纂逆溄Y(jié)構(gòu)發(fā)生異變。醋酸纖維素薄膜電泳，為異常血紅蛋白的篩選、診斷提供了可靠的途徑和依據(jù)。地中海貧血即是異常血紅蛋白的典型病例.醋酸纖維素薄膜電泳，為異常血紅蛋白的篩選、診斷提供了可靠的途

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（ExperimentalObjectives）：

1.掌握血清脂蛋白測定的臨床意義;2.了解血清脂蛋白電泳的基本原理及操作方法。血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康难逯鞍椎姆诸?/p>

1.按電泳法分

乳糜微粒（CM）

-脂蛋白

前

-脂蛋白

-脂蛋白血清脂蛋白的分類

1.按電泳法分2.按超速離心法分乳糜微粒(CM)(<0.96)極低密度脂蛋白（VLDL)(0.96

1.006)中間密度脂蛋白(IDL)(1.006

1.019)低密度脂蛋白（LDL）(1.019

1.063)高密度脂蛋白（HDL）(1.063

1.21)

2.按超速離心法分乳糜微粒(CM)((修改)實(shí)驗(yàn)四__Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳課件二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciples)：血清中的脂類物質(zhì)，都是以不同的比例與蛋白質(zhì)（載脂蛋白）結(jié)合成脂蛋白而存在。在PH8.6的緩沖液中，脂蛋白均帶負(fù)電荷，在電場中移向正極。各種脂蛋白因其所帶有的電荷量以及顆粒大小、形狀等不同，在電場中泳動(dòng)的速度也不一樣，故可將其分離，用不同方法顯色便可以進(jìn)行定性、定量分析。用瓊脂糖凝膠作支持物進(jìn)行電泳時(shí)，先將血清用蘇丹黑B（脂類染料）預(yù)染，使脂蛋白著色，經(jīng)電泳后可將血清脂蛋白分成三條清晰的區(qū)帶，可用光密度計(jì)掃描定量。二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciple三、操作步驟（OperatingProcedure）1．預(yù)染血清：取小試管一只，加入血清0.2ml及蘇丹黑B染料液0.02ml，混勻后置于37°C水浴中預(yù)染30分鐘備用。（這一步由老師提前做好，同學(xué)免做）2.制備瓊脂糖膠板：0.45%的瓊脂糖凝膠溶解后，將凝膠溶液均勻灌注于制膠板上，厚約0.5cm，靜置約半小時(shí)后凝固。此時(shí)，小心取出上樣梳，凝膠板上出現(xiàn)小凹槽即上樣孔。三、操作步驟（OperatingProcedure）1．3.點(diǎn)樣：用微量加樣器吸取預(yù)染血清15μl，注入上述凹槽內(nèi)。4.電泳：將點(diǎn)樣的凝膠板放于電泳槽中，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，平衡5分鐘。接通電源，調(diào)電壓100V，約45分鐘，看到各區(qū)帶已分開，即可關(guān)掉電源，取出凝膠板。3.點(diǎn)樣：用微量加樣器吸取預(yù)染血清15μl，注入上述凹槽內(nèi)。(修改)實(shí)驗(yàn)四__Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳課件(修改)實(shí)驗(yàn)四__Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳課件四、結(jié)果與分析

（ResultsandAnalysis）

肉眼觀察各區(qū)帶的顏色深淺寬窄及其排列順序，繪圖記錄之。四、結(jié)果與分析

（ResultsandAnalysis五、臨床意義：

1.正常人血清脂蛋白瓊脂糖電泳，可分離出三條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白，原點(diǎn)處應(yīng)無乳糜微粒。

2.參考值：α-脂蛋白：20~30%

前β-脂蛋白：0~28.6%β-脂蛋白：67%五、臨床意義：

1.正常人血清脂蛋白瓊脂糖電泳，可分離出CMCM正常人脂蛋白電泳譜上β-脂蛋白含量＞＞α-脂蛋白含量＞前β-脂蛋白。前β-脂蛋白含量少時(shí)，在一般電泳譜上看不出來。正常人空腹血漿中雖有微量的乳糜微粒，但