elisa試驗的操作要點

elisa試驗的操作要點

酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）是軍隊血液采集中最常用的檢測方法之一，但操作中的各個階段都對檢測結果有很大影響。主要連接包括：樣品的保存和運輸、試劑的使用和維護、機器的維護和維護；添加樣品、加熱培訓、清潔、油漆、顏色和測量；檢測結果的輸入和測試。由于操作不當，試驗結果將影響。只有在這三個方面，員工才能確保elisa檢測的準確性，保證輸血安全。1檢測前的質(zhì)量控制1.1elisa試驗過程高質(zhì)量的標本是保證ELISA質(zhì)量的前提,所以標本的留取必須符合質(zhì)量要求。為了保障標本留取的正確,在采血時,貼好標簽后一定要重新核對一遍,避免一人同時采兩個或多個血標本時拿錯標簽。在留樣時,應將血袋上的標簽和試管上的標簽再核對一遍。現(xiàn)已有軟件要求將標本和血袋捆綁在一起,在電腦上進行血液和標本雙掃碼,同時接收,若有不一致馬上出現(xiàn)提示,如發(fā)現(xiàn)錯誤,要將其另行放置,并查找原因,及時進行糾正。標本留取需要加抗凝劑,有文獻報道,CPD血液保存液的成分可能對ELISA試驗的反應環(huán)境有影響,產(chǎn)生抑制作用,造成弱陽性標本判為假陰性,而漏檢。要保障標本的質(zhì)量,還要建立嚴格的標本采集、傳遞、儲存、運輸制度。標本離心要徹底,防止其中懸浮血凝塊、血細胞、纖維蛋白,影響加樣和檢測結果。對于一些不能立即檢測的標本,要及時分離出血清或血漿,放在-20℃以下冰箱保存,以備用。1.2b液的密封與保存試劑要在專門的試劑冰箱儲存,并每天按時進行溫度登記。試劑使用時,要看試劑瓶蓋是否完好,有無溢漏。試劑的量是否夠,板條是否密封。底物B液一般都在黑色試劑瓶閉光保存,以防失效。酶和板條若一次用不完,最好在用完后先放冰箱保存,試劑用完后,要將瓶蓋擰好。未開封且在保存溫度范圍內(nèi)試劑的有效期一般都是1年,對于開封后的試劑,再用時檢測結果往往偏低,對于一些弱陽性標本可能造成假陰性。因此,建議試劑打開后要盡快用完。1.3強化儀器設備的操作規(guī)程隨著自動化辦公的普及,ELISA基本淘汰了純手工操作,儀器的使用在血液檢測中是必不可少的。目前主要使用的儀器有全自動酶聯(lián)免疫分析儀、全自動加樣儀、酶標儀、洗板機、加樣槍等。因此必須建立所有儀器設備的操作規(guī)程,制訂實施儀器設備的定期維護保養(yǎng)計劃,定期檢定、校準,貴重儀器應有單獨的防護罩等,確保儀器設備的準確性和穩(wěn)定性。在操作過程中嚴格執(zhí)行操作規(guī)程,并觀察儀器運行狀況,以便及時發(fā)現(xiàn)問題隨時解決。如在加樣時,標本離心不好,可能造成標本加樣不夠或漏加,這時應及時記錄下來,按時補上。此外,還需要做好儀器使用記錄、故障檢修記錄、維護保養(yǎng)記錄、校準和校準驗證記錄等,從各個方面確保檢測結果的準確性。2檢測到的質(zhì)量控制2.1a板孔的底部ELISA試驗一般分四步:加樣即加標本、酶結合物、底物及終止液。用微量加樣器加樣時應將所加樣物加在ELISA板孔的中底部,注意不要濺出,不要產(chǎn)生氣泡。采用全自動儀器進行加樣時,可能會遇到高濃度的抗原或抗體,出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象,造成假陽性,需要再重新剪血袋的小辮手工檢測。加陰陽性對照和質(zhì)控品時不要污染別的板孔,手工加一些無色試劑時如底物,一定要看清楚,最好每加完一種試劑,都要看一下孔內(nèi)液面的高度,避免漏加、少加。2.2溫度大小對主導地位的影響抗原和抗體完全反應必須在一定的溫度下反應一段時間。溫育通常一般都在水浴箱中,溫度多控制在37℃左右,溫度低反應時間長,相反溫度高反應時間短,因此必須嚴格控制好溫度。溫育時間必須按說明書操作,溫育時間過長或過短,都可能造成假陰性,尤其不能因某些原因而縮短溫育時間,否則易造成假陰性,后果非常嚴重。2.3洗板機的影響有時因板條制作不好,板條與板條之間的距離不相等,可能使洗板機的針打到板條的邊上,或針孔堵塞,因此,在第一次洗板時一定要仔細觀察洗板機,及時進行調(diào)整以免造成花板,而進行重復試驗。手工洗板時也要嚴格控制洗板次數(shù),增加洗板次數(shù)會造成部分與固相結合的抗原抗體脫離,從而影響檢測的靈敏度,使樣本檢測的吸光度(OD)值偏低。洗液要勤更換,避免滋生細菌。2.4試劑瓶和試劑瓶顯色劑有A和B兩種,B液一般怕光,要用棕色或黑色試劑瓶盛放,并且不能長期在空氣中暴露。酶標儀通過測OD來求值,有時可能因為板底有水汽造成測量值偏高或假陽性,用雙波長測量可消除一些干擾因素,結果更準確。2.5灰區(qū)的設置和用量陰性和陽性用Cut-Off(CO)值來判定。CO值上下的“灰區(qū)”應引起重視。發(fā)生灰區(qū)反應提示有一定的抗原抗體活性存在,因為在感染早期,由于抗體或抗原含量較低,僅出現(xiàn)OD值輕微升高是可能的。所有感染的個體實際上在某一階段均經(jīng)過了灰區(qū)。為防止漏檢,提高輸血的安全性,灰區(qū)的設置有著重要的意義。對灰區(qū)反應的標本有條件的單位應用更靈敏、更特異的方法來復查,無條件者應對血液做報廢處理,以增加血液的安全系數(shù)。3結果與報告單的關系檢測完成后需要對檢測結果進行核對,首先是酶標板肉眼觀測的結果是否與報告單一致,有時因酶標板底部不干凈,使測試結果OD值高于CO值,而造成假陽性。其次核對結果的輸入是否正確,陽性標本做不合格報廢處理,陰性標本合格入庫。4工作人員4.1檢驗程序優(yōu)化管理者雖不直接參與ELISA,但對檢測起著決定性的作用。因為他們需要為實驗室建立內(nèi)部質(zhì)量管理體系,如統(tǒng)一的標準操作規(guī)程、檢驗程序文件、各種檢驗記錄等。他們還是下屬人員錄用的決定者,也是對制度優(yōu)化和完善者。因此管理者必須是一名有能力建立一套能覆蓋所有檢驗項目試驗過程和結果的質(zhì)量控制方案的領導者,有能力對下屬人員、儀器設備、試驗過程、試驗結果進行質(zhì)量管理和控制,不但要以身作則,而且要嚴格監(jiān)督下屬人員準確完整地執(zhí)行操作規(guī)程和質(zhì)量標準。4.2感官性能的測定品質(zhì):良好的職業(yè)道德和高質(zhì)量意識。體質(zhì):健康的體魄和優(yōu)良的感官性能。知識:有足夠的專業(yè)知識、實踐經(jīng)驗、外語知識和質(zhì)量控制知識。技能:有熟練的實驗操作技能、儀器操作技能、試劑配置技能和較強的分析判斷能力。4.3加強檢測過程控制首先,要每天按時消毒,搞好實驗室衛(wèi)生,對各種儀器進行檢查、維護和登記。其次,工作時一定要按規(guī)程操作,尤其是質(zhì)控品、陰性對照和陽性對照不要漏加。試驗時每個板都要做好項目標記,板條也要用數(shù)字標記好,放到酶標板的相應位置上,板條放不好,可能將試劑加到孔外或卡住槍頭,還可能影響洗板或酶標儀的測量。每一個過程和接口及儀器設備都必須按標準規(guī)程操作。再次,做好室內(nèi)質(zhì)控,當發(fā)現(xiàn)一次測定未達到質(zhì)量標準時,應充分發(fā)揮所掌握的知識來分析判斷,只有這樣,才能找到失控的真正原因,避免同類現(xiàn)象重復出現(xiàn)。最后,認真核對試驗結果,尤其是陽性或可疑標本一定要核對準確。原始記錄要完整、及時、真實、規(guī)范并長期保存。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗結果的精密度,精密度高不一定準確度高,因此實驗室還應參加各地區(qū)、省或國家舉辦的室間質(zhì)量評價,來校正試驗結果的準確性,從而