何首烏毛狀根對(duì)倍半類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究

何首烏毛狀根對(duì)倍半類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究

通過(guò)在植物細(xì)胞、組織或轉(zhuǎn)化器官等生物體系中添加特定的外源化合物或功能物質(zhì)，以獲得具有價(jià)值的各種化學(xué)產(chǎn)物的過(guò)程，稱為植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。由于高等植物中的次生代謝產(chǎn)物量相對(duì)很低且有些產(chǎn)物不能或難于通過(guò)化學(xué)合成途徑得到,因此,人們期望能夠充分利用植物組織培養(yǎng)以及植物酶對(duì)外源底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到目標(biāo)化合物。其中很多反應(yīng)具有區(qū)域選擇性及立體特異性,其反應(yīng)類型包括氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、羥基化反應(yīng)、甲基化反應(yīng)、乙?；磻?yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)、糖基化反應(yīng)以及酯化反應(yīng)等。Furannoligularenone屬于eremophilane型倍半萜,為菊科橐吾屬植物的主要活性成分。該屬植物具有止咳化痰、活血化瘀等功效,多種藥材的根及根莖用作中藥“紫菀”的代用品。目前用于生物合成/轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)系統(tǒng)很多,包括愈傷組織(callus)、器官培養(yǎng)、毛狀根(hairyroot)等。由于毛狀根系統(tǒng)具有生長(zhǎng)迅速、不需加入外源激素、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn),越來(lái)越受到重視。本研究組利用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染何首烏PolygonummultiflorumThunb.的無(wú)菌苗誘導(dǎo)得到何首烏毛狀根,以考察其對(duì)倍半萜類化合物的轉(zhuǎn)化能力。1材料和方法1.1培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和培養(yǎng)時(shí)間所用培養(yǎng)基為無(wú)激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖濃度為30g/L,在消毒前pH調(diào)至5.75,分裝至250ml培養(yǎng)瓶,每瓶100ml,121℃滅菌20min。控制接種量為每100ml培養(yǎng)基5g鮮重毛狀根(折合干重約為0.5g)。25℃振蕩暗培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速為110r/min;繼代周期為12d。一般懸浮培養(yǎng)連續(xù)繼代3次后,獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)體系,可用作生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1.2基本內(nèi)容Furannoligularenone,王乃利教授惠贈(zèng),HPLC檢測(cè)純度>98%。1.3底物甲醇溶液的培養(yǎng)精確控制接種量,往3瓶預(yù)培養(yǎng)了9d的何首烏毛狀根培養(yǎng)瓶中分別加入20mg/ml的底物Ⅰ甲醇溶液0.5ml,迅速搖勻。同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。另取3瓶培養(yǎng)物,每瓶加入相同體積的甲醇(不含底物)作為空白對(duì)照。1.4提取液、培養(yǎng)基底物加入培養(yǎng)物中,共培養(yǎng)一段時(shí)間后,抽濾,分別獲得何首烏毛狀根培養(yǎng)物和培養(yǎng)基。培養(yǎng)物于55℃條件下烘干至恒重,乳缽研細(xì),稱取10mg粉末于容量瓶中,甲醇定容至5ml,超聲提取1h后,甲醇補(bǔ)足至刻度;培養(yǎng)基定容至100ml后,取10ml,-20℃保存。HPLC分析前,將提取液、培養(yǎng)基經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后用于HPLC檢測(cè)。同法平行處理對(duì)照組培養(yǎng)基和培養(yǎng)物,進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件:流動(dòng)相為55%甲醇-水;流速為1.0ml/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;進(jìn)樣量10μl。1.5培養(yǎng)基浸提液制備將200mg底物Ⅰ投入預(yù)培養(yǎng)9d的何首烏毛狀根中,共培養(yǎng)6d。抽濾,分別獲得培養(yǎng)物和培養(yǎng)基。培養(yǎng)物55℃條件下烘干至恒重,甲醇提取。合并提取液和培養(yǎng)液,減壓濃縮,得浸膏。行硅膠柱層析,丙酮:石油醚梯度洗脫;合并產(chǎn)物,甲醇溶解,上SephadexLH-20柱,甲醇洗脫,經(jīng)重結(jié)晶,得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅱ(8mg)和Ⅲ(6mg)。1.6底物共培養(yǎng)液制備精確控制接種量,向18瓶預(yù)培養(yǎng)了9d的何首烏毛狀根培養(yǎng)瓶中分別加入20mg/ml底物甲醇溶液0.5ml,培養(yǎng)條件同上。分別在共培養(yǎng)1、2、3、4、5和6d后取出3瓶終止轉(zhuǎn)化。抽濾獲得培養(yǎng)物和培養(yǎng)基,處理方法同1.4項(xiàng)。2結(jié)果與分析2.1實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的HPLC譜圖(圖1)可看出,在實(shí)驗(yàn)組中存在2個(gè)新色譜峰(保留時(shí)間tR約為6.2min和6.8min),結(jié)合TLC結(jié)果可以初步判定該生物轉(zhuǎn)化是成功的。2.2cnmr格局化合物Ⅱ:C15H18O3,無(wú)色針晶,mp:184～186℃。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:6.67(dd,J=10.0,2.0Hz,H-1),6.00(dd,J=10.0,3.2Hz,H-2),2.50(q,J=6.8Hz,H-4),2.34(d,J=13.5Hz,H-6a),2.82(d,J=13.5Hz,H-6b),4.93(m,H-8),1.47(dd,J=12.3,1.4Hz,H-9a),2.58(dd,J=13.6,6.8Hz,H-9b),2.91(m,H-10),1.79(t,J=1.71Hz,H-13),0.62(s,H-14),1.12(d,J=6.8Hz,H-15)。13CNMRδ:151.9(C-1),130.2(C-2),202.5(C-3),44.2(C-4),45.0(C-5),35.2(C-6),161.9(C-7),81.5(C-8),37.9(C-9),55.0(C-10),123.6(C-11),176.6(C-12),8.0(C-13),11.5(C-14),7.6(C-15)。參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù),化合物Ⅱ鑒定為3-oxo-eremophila-1,7(11)-dien-12,8-olide?；衔铫?C15H18O4,無(wú)色針晶,mp:204～206℃。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:6.83(dd,J=10.0,2.0Hz,H-1),6.15(dd,J=10.0,3.3Hz,H-2),2.78(q,J=6.8Hz,H-4),2.52(br.d,J=13.2Hz,H-6a),2.86(d,J=13.1Hz,H-6b),1.89(t,J=13.4Hz,H-9a),2.54(dd,J=13.2,3.4Hz,H-9b),3.24(br.dd,J=11.5,1.0Hz,H-10),1.95(d,J=1.56Hz,H-13),0.78(s,H-14),1.27(d,J=6.86Hz,H-15)。13CNMRδ:152.1(C-1),130.0(C-2),202.6(C-3),44.6(C-4),45.6(C-5),36.8(C-6),169.2(C-7),104.7(C-8),39.7(C-9),55.1(C-10),125.4(C-11),173.9(C-12),8.0(C-13),10.9(C-14),7.5(C-15)。參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù),化合物Ⅲ為3-oxo-8-hydroxy-eremophila-1,7(11)-dien-12,8-olide。2.3樣品的生物合成方法由產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),推測(cè)底物Ⅰ和產(chǎn)物之間可能存在如下的生物合成途徑:2.4培養(yǎng)基中各產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率從圖2可看出,在考察的6d中,產(chǎn)物Ⅱ在培養(yǎng)物和培養(yǎng)基中的變化趨勢(shì)相似:隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加,第3d達(dá)到最高,在培養(yǎng)物中的量達(dá)到42.5mg/L;在培養(yǎng)基中僅有1.8mg/L,此時(shí)產(chǎn)物Ⅱ的總轉(zhuǎn)化率最高為20.7%。共培養(yǎng)的第1d時(shí)分泌率最高(5.6%),而后隨著產(chǎn)物產(chǎn)量的增加分泌率反而下降,可能是由于培養(yǎng)體系對(duì)產(chǎn)物存在反饋抑制。2.5培養(yǎng)基中產(chǎn)物的總轉(zhuǎn)化率從圖3中可以看出,產(chǎn)物隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈先升后降的趨勢(shì),產(chǎn)物在培養(yǎng)物中含量第5d時(shí)升至最高(29.9mg/L),此時(shí)產(chǎn)物Ⅲ的總轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最大(12.1%);而在培養(yǎng)基中產(chǎn)物量先逐漸上升,第3d時(shí)量最多(1.69mg/L),而后開(kāi)始下降。產(chǎn)物的分泌率在共培養(yǎng)的第1d最高,為15.0%。2.6共培養(yǎng)時(shí)間和產(chǎn)物的量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅱ和Ⅲ均隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先逐漸升至最高值再開(kāi)始降低,但兩者并非同時(shí)達(dá)到最高峰,其中當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為3d時(shí)產(chǎn)物Ⅱ的量達(dá)到最高,分泌率僅有4.1%,此時(shí)總的轉(zhuǎn)化率為最高值27.2%。而產(chǎn)物Ⅲ的量在5d時(shí)才達(dá)到最高,分泌率僅有4.4%。在實(shí)驗(yàn)考察范圍內(nèi)產(chǎn)物Ⅱ的分泌率都在5.6%以下,Ⅲ的分泌率都在15%以下。綜合分析:最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d。總之,對(duì)于底物Ⅰ在何首烏毛狀根中的轉(zhuǎn)化過(guò)程而言,產(chǎn)物主要在培養(yǎng)物中累積。3活性物質(zhì)的降解本研究利用何首烏毛狀根對(duì)倍半萜類化合物furannoligularenone進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究并獲得成功,底物在系統(tǒng)中發(fā)生了氧化反應(yīng)和羥基化反