圓二色譜資料

圓二色光譜(簡稱CD)是應(yīng)用最為廣泛的測定蛋白質(zhì)二級構(gòu)造較準(zhǔn)確的方法。它可以在溶液狀態(tài)下測定，較接近其生理狀態(tài)。而且測定方法快速簡便，對構(gòu)象變化靈敏，所以它是目前爭論蛋白質(zhì)二級構(gòu)造的主要手段之一，并已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象爭論中。一．簡介圓二色譜是用于推斷非對稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的一種旋光光譜。光學(xué)活性物質(zhì)對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸取系數(shù)(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圓二色性。假設(shè)以不同波長的平面偏振光的波長λ為橫坐標(biāo)，以吸取系數(shù)之差Δε=εL-εR為縱坐標(biāo)作圖，得到的圖譜即是圓二色光譜，簡稱CD吸取，就可以得到具有特征的圓二色光譜。由于εL≠εR，[θ]與Δε的關(guān)系為：[θ]=3300Δε。圓二色譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖。由于△ε有正值和負值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負性圓二色譜。在紫外可見光區(qū)域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。二．樣品要求1、樣品必需保持確定的純度不含光吸取的雜質(zhì)，溶劑必需在測定波長沒有吸取干擾;樣品能完全溶解在溶劑中,形成均一透亮的溶液。2、氮氣流量的把握3、緩沖液、溶劑要求與池子選擇：緩沖液和溶劑在配制溶液前要做單獨的檢查，看是否在測定波長范圍內(nèi)有吸取干擾，看是否形成沉淀和膠狀；在蛋白質(zhì)測量中，常常選擇透亮性極好的磷酸鹽作為緩沖體系。4 樣品濃度與池子選擇(光徑)的選擇和濃度的要求也不一樣。蛋白質(zhì)CD光譜測量一般在相對較稀的溶液中進展。三．譜帶寬度選為1nm。對于高區(qū)分率測量，要用較窄的狹縫寬度，此時間電倍增管的電壓較高，譜的信噪比差。雖然對于正常測量最正確譜帶寬度是1~2率CD信號很CD一方面要設(shè)置較寬的狹縫。不過此時要特別留神，由于樣品在吸光度過高(A>2)的狀況下可能存在熒光或雜散光引起的CD光譜測試時也需要較大的狹縫寬度(一般要求2nm)。波長和樣品濃度總是應(yīng)當(dāng)特別注明的。當(dāng)用壓片法或石蠟油研磨法進展固體粉末樣品測試時，要盡可能地研磨獲得細小均勻的樣品顆粒。承受石蠟油糊方法時，必需留意某些憎水有機化合物可能溶于石蠟油中，這時所得CD光譜在某種意義上應(yīng)視為溶液CD法測試固體CDCD光譜儀檢測要求的同時，片越薄越透亮越好(但切忌破損)。在某些狀況下，壓片法不適用于手性抗衡陰離子存在下的固體誘導(dǎo)CD光譜的測定。使用壓片機須留意：①FW-42437.5MP，超過此極限簡潔損壞機器，請不要任憑加壓。8噸(12.5MP)即可，KBr(KCl)50mg時能獲得較光滑均勻的片膜。0，請馬上旋松油閥，檢查壓力表是否損壞。④機器放置一段時間未使用，在使用前可旋緊放油閥，加壓至15MP，再旋松放油閥。如此反復(fù)幾次，即可正常使用。⑤壓片完成后，請用棉花蘸取少量酒精將壓片模具和研缽洗干凈，置于紅外燈下烘干后再將壓片模具放回枯燥器中。壓片剩余的固體粉末和使用過的棉花倒入垃圾桶中。在紫外區(qū)進展光譜掃描時，J-810型CD光譜儀的耗氮量為：3L/min(190~400nm)；3~5L/min(185nm)；10因此當(dāng)測定蛋白等樣品的遠紫外光譜時，必需增加氮氣的流量，以避開臭氧對紫外光產(chǎn)生的吸取干擾光譜的測定。對獵取抱負的溶液或固體CD譜圖的建議：CD光譜測試的條件(在給定波長范圍內(nèi)有較強的CD信號和適宜的吸取值)。必需事先測定手性樣品的UV-Vis吸取光譜(溶液或固體漫反射)，推想CD譜峰的可能位置和選擇適宜的制樣濃度(對于溶液吸取光譜，A1)。(溶液、固體、單CD)。(見附表)光程(與測定UV-Vis光譜類似)。對于在紫外區(qū)測試的樣品建(≤0.5cm)為高純水或醇類溶劑(見附表)。⑤對固體樣品的壓片法測試，應(yīng)視樣品的不同選用適宜百分比濃度及適宜的稀釋劑KBr、KClCsI等)研磨壓片后進展透射掃描。⑥選擇適當(dāng)?shù)臏y定參數(shù)(波長范圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等)。CD光譜加以比較。CD光譜，CD信號的真?zhèn)魏驮诙康臈l件下相互印證其對映純度。三．原理光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量E與磁場矢量H由于產(chǎn)生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。假設(shè)此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面。平面偏振光可分解為振幅、頻率一樣，旋轉(zhuǎn)方向相反的兩圓偏振光。其中電矢量以順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右旋圓偏振光，其中以逆時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為左旋圓偏振光。兩束振幅、頻率一樣，旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。假設(shè)兩束偏振光的振幅(強度)不一樣,則合成的將是一束橢圓偏振光。,其光吸收的差值ΔA(=AL-AR)稱為該物質(zhì)的圓二色性(circulardichroism,簡寫作CD)。圓二色性的存在使通過該物質(zhì)傳播的平面偏振光變?yōu)闄E圓偏振光,且只在發(fā)生吸取的波特長才能觀看到。依據(jù)Lambert-Beer定律可證明橢圓率近似地為：θ=0.576lc(εL-εR)=0.576lcΔε公式中l(wèi)為介質(zhì)厚度,c為光活性物質(zhì)的濃度,εL及εR分別為物質(zhì)對左旋及右旋圓偏θ(或Δε)值與波長λ之間的關(guān)系曲線,即圓二色光譜曲線。在此光譜曲線中,假設(shè)所測定的物質(zhì)沒有特征吸取,則其Δε值很小,即得不到特征的圓二色光譜。當(dāng)εL>εR時,得到的是一個正的圓二色光譜曲線,即被測物質(zhì)為右旋,假設(shè)εL<εR,則得到一個負的圓二色光譜曲線,即被測物質(zhì)為左旋。依據(jù)圓二色光譜法的原理和測試要求設(shè)計制成的儀器稱為圓二色光譜儀。目前圓二色光譜法及其儀器已廣泛應(yīng)用,成為研究有機化合物的立體構(gòu)型的一個重要方法。四．應(yīng)用1.氨基酸的圓二色性可見光區(qū)：各種氨基酸都沒有光吸取。紫外光區(qū)：置于芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈的不同局部可分別形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等特定的立體構(gòu)造。這些立體構(gòu)造都是不185～240納米處有光吸取，因此它在這一波長范圍內(nèi)有圓二色性。幾種不同的蛋白質(zhì)立體構(gòu)造所表現(xiàn)的橢圓值波長的變化曲線──圓二色譜是不同的。如(圖3)所示，α-螺旋的譜是雙負峰形的，β-折疊是單負峰形的，無規(guī)卷曲在波長很短的地方出單峰。蛋白質(zhì)的圓二色譜是它們所含各種立體構(gòu)造組分的圓二色譜的代數(shù)加和曲線。因此用這一波長范圍的圓二色譜可爭論蛋白質(zhì)中各種立體構(gòu)造的含量。蛋白質(zhì)含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它們在240～350納米處有光吸取,當(dāng)它們處于分子不對稱環(huán)