四君子湯煎膏劑提取工藝的優(yōu)化

四君子湯煎膏劑提取工藝的優(yōu)化

四君子湯是宋代太平惠民和菊花的配方。它由人參（實(shí)驗(yàn)中的黨參取代）、甘草、椰子和白術(shù)組成。均為補(bǔ)氣之藥,主治脾胃氣虛,為治療脾胃氣虛證的基礎(chǔ)方,后世眾多補(bǔ)脾益氣方劑多從此方衍化而來。其作為滋補(bǔ)類的經(jīng)典方劑,在臨床上廣泛應(yīng)用。膏方出現(xiàn)在我國(guó)最早的醫(yī)方書《五十二病方》中,是中醫(yī)用于強(qiáng)身健體、防衰老、治療慢性疾病的傳統(tǒng)劑型之一。近年來,膏方在臨床上廣泛應(yīng)用。中醫(yī)膏方用量逐年遞增,尤以南方地區(qū)為主。但是,膏方的生產(chǎn)操作規(guī)程目前均由生產(chǎn)單位自行擬定,并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),而監(jiān)管單位也不一,檢查頻率較少,膏方的質(zhì)量堪憂。目前關(guān)于四君子湯煎膏劑提取工藝的研究還缺少詳細(xì)報(bào)道,為建立科學(xué)合理的提取工藝,進(jìn)一步推動(dòng)四君子湯的臨床應(yīng)用開發(fā)及膏方市場(chǎng)的發(fā)展,本文以四君子湯煎膏劑為例,對(duì)其提取工藝的參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究,在保留原方的基礎(chǔ)上,以中醫(yī)理論為指導(dǎo),利用現(xiàn)代科技方法,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),采用多指標(biāo)綜合考察,優(yōu)選四君子湯煎膏劑的提取工藝條件。1實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑、標(biāo)準(zhǔn)品甘草、炒白術(shù)、茯苓、黨參均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供;甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110731-201116),氨水、醋酸、甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠炮制中心實(shí)驗(yàn)室提供,水為超純水。1.2檢測(cè)柱溫箱、設(shè)備高效液相色譜儀(戴安U3000,XPG-3X00泵,WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),TCC-3X00柱溫箱,VWD-3X00紫外檢測(cè)器);電子分析天平(XS105型,瑞士METTLER-TOLEDO);烘箱(XMTD-8222,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);三用恒溫水浴箱(DK-600S,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);電子燉盅(依立牌ZSD18-A);電磁爐等。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:ZORBAXExtend-C18柱(4.6×150mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2mol·L-1醋酸銨溶液—冰醋酸(72∶28∶1);流速:1ml·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):250nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μl。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照溶液的制備取甘草酸銨5mg,精密稱定,置于25ml容量瓶中,加0.5%氨溶液-甲醇(1∶1)的混合溶液至刻度,搖勻,即得。2.2.2定容、搖勻、搖勻取四君子湯濃縮液1ml,置10ml容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻。取適量藥液于12000r·min-1條件下離心,上清液用0.45μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。2.2.3陰性樣品溶液的制備2.3系統(tǒng)適用性測(cè)試：如下2.3.1樣品測(cè)定和色譜圖示法按照“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項(xiàng)分別制備3份待測(cè)液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀,結(jié)果A(對(duì)照品)的主峰保留時(shí)間為5.0分鐘,B(陰性樣品)在保留時(shí)間5.0分鐘內(nèi)無干擾峰,C(供試品)在保留時(shí)間5.0分鐘時(shí)出峰。色譜圖見圖1。2.3.2待測(cè)峰理論塔板數(shù)的測(cè)定按“2.2.2”項(xiàng)制備一份供試品,在“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀,測(cè)得待測(cè)峰理論塔板數(shù)n>2000,R>1.5,T在0.95~1.05之間,符合要求。2.4法律研究2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程分別精密吸取10、20、30、50、80μL的對(duì)照品溶液,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo),以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程:Y=165.6466X-0.0501(r=0.9999)。線限范圍:表明對(duì)照品溶液在0.1~0.8mg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.4.2進(jìn)樣精密度試驗(yàn)精密吸取甘草酸銨對(duì)照品溶液20μl,按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)得其平均峰面積為33.012,RSD為0.12%,表明精密度良好。2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果取同一批樣品5份,按2.2.2項(xiàng)方法制得樣品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得甘草酸銨平均總含量為255.07mg,RSD為0.25%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。2.4.5加標(biāo)回收率的測(cè)定精密量取已知濃度的濃縮液9份各1ml,分別精密加入1ml甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品。按供試品的制備處理測(cè)定各峰面積,計(jì)算回收率。平均回收率為98.77%,RSD為2.73%(見表1)。2.5提取工藝條件評(píng)價(jià)：下一步2.5.1蒸干、冷卻稱定濃縮液的總重量,取供試品濃縮液5g,置于已經(jīng)稱定重量的蒸發(fā)皿,水浴蒸干,再置于100~105℃的烘箱中3h,移至干燥器中冷卻30分鐘,精密稱重。繼續(xù)置于100~105℃的烘箱中1h,冷卻,稱重,至連續(xù)2次稱重恒重為止,得到供試品干重,按下列公式計(jì)算出膏率。2.5.2得甘草酸提取率正交試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選取浸泡溫度、加水倍數(shù)、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)5個(gè)影響因素,按照L18(37)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),正交試驗(yàn)因素水平見表2。將供試品中測(cè)得的甘草酸含量除以處方甘草飲片的甘草酸含量即得甘草酸提取率,正交試驗(yàn)結(jié)果見表5,方差分析見表3。由方差分析可知,煎煮次數(shù)對(duì)結(jié)果顯著性影響。偏差平方和E>B>C>D>A,即煎煮次數(shù)的影響最大,浸泡溫度的影響最小。直觀分析A因素A2>A3>A1,B因素B3>B2>B1,C因素C3>C2>C1,D因素D2>D3>D1,E因素E3>E2>E1。由以上數(shù)據(jù)分析可知,煎煮次數(shù)對(duì)提取工藝有顯著影響,所以選擇煎煮3次。其他因素均無顯著影響,可按影響水平的大小以及經(jīng)濟(jì)角度考慮選擇。最后確定的最佳工藝為A1B3C2D2E3。即在30℃,加12倍水量浸泡120min,煎煮3次,每次90min。2.6試驗(yàn)結(jié)果及分析取10倍處方量藥材,按上述分析中的最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表4。平均出膏率為39.93%,RSD為0.14%,甘草酸的平均提取率為86.95%,RSD為0.13%。結(jié)果表明優(yōu)化的四君子湯煎膏劑的提取工藝穩(wěn)定可行。3提取工藝條件的優(yōu)化中藥制劑提取工藝的科學(xué)合理性直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量與療效。有研究表明,在室溫下浸泡的時(shí)間越長(zhǎng),甘草酸的提取率越高,但是超過90分鐘,提取率幾乎無變化;浸泡溫度的升高對(duì)提取率有明顯影響。本文選擇煎煮次數(shù)、加水倍數(shù)、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、浸泡溫度等影響因素,參考2010版《中國(guó)藥典》中四君子丸有效成分的測(cè)定指標(biāo),以出膏率和甘草酸的提取率為指標(biāo),設(shè)計(jì)L18(3)7正交試驗(yàn)對(duì)四君子湯煎膏劑進(jìn)行提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。結(jié)果表明,影響提取結(jié)果的關(guān)鍵因素依次是煎煮次數(shù)、加水倍數(shù)、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、浸泡溫度。除煎煮次數(shù)外,其他條件對(duì)結(jié)果均無顯著性影響。因此,根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,綜合經(jīng)濟(jì)效益考慮,確定的提取工藝參數(shù)為A1B3C2D2E3,即在30℃,加12倍水量浸泡120min,煎煮3次,每次90min。在所選提取工藝條件下工藝驗(yàn)證,結(jié)果表明工藝重現(xiàn)性良好,提示優(yōu)選工藝條件可行?？蔀樗木蛹甯鄤┑闹苽溲芯刻峁﹨⒖?。曾某等以人參皂苷的含量為指標(biāo)對(duì)四君子湯水提工藝進(jìn)行了研究,張某等以人參皂苷的含量以及浸膏得率為指標(biāo)對(duì)四君子膠囊的提取工藝進(jìn)行研究。本文優(yōu)化的四君子湯煎膏劑提取工藝參數(shù),有所不同,可能與劑型、工