丹莪婦康煎膏對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠gf-的影響

丹莪婦康煎膏對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠gf-的影響

子宮內(nèi)膜綜合征（ius）是一種常見的疾病，其病因和發(fā)生機(jī)制相對(duì)復(fù)雜。近年來的研究表明，該病的形成與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)異常有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是一種以抑制免疫為主的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,它可抑制T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的增殖和活化,同時(shí)可活化血管生長(zhǎng)因子。而異位內(nèi)膜逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視,局部種植、粘連的形成可能與之有關(guān)。本研究通過研究丹莪婦康煎膏對(duì)EMS模型大鼠TGF-β表達(dá)的影響,探討丹莪婦康煎膏治療EMS的可能作用機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)用試劑雌性成熟未交配過的SD大鼠,體重(220±30)g,由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在溫、濕度控制的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠,研究期間可隨意進(jìn)飲食。丹莪婦康煎膏由昆明滇虹藥業(yè)有限公司提供,批號(hào):100801,以0.5%羧甲基纖維素鈉配制。ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(MBIFermentas公司);TGF-β和內(nèi)參引物的合成(上海生工生物工程技術(shù)公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1引產(chǎn)轉(zhuǎn)移,關(guān)腹縫合在大鼠發(fā)情期,模型組和治療組大鼠以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,常規(guī)消毒開腹,右側(cè)離卵巢0.5cm處分離子宮,結(jié)扎后在中間剪取一段2cm的子宮,剖開子宮剝離子宮內(nèi)膜,將內(nèi)膜縫于左側(cè)腹膜壁層,關(guān)腹縫合?？瞻捉M行同樣手術(shù)過程,但僅暴露子宮。1.2.2給藥周期及給藥次數(shù)將大鼠隨機(jī)分組,每組10只,均于造模后15d給藥,1次/d,周期1個(gè)月。治療組以7.59g/kg的丹莪婦康煎膏藥液灌胃;空白組和模型組予相同體積的生理鹽水灌胃。1.2.3elisa反應(yīng)總od450末次給藥后,股靜脈采血,采用TGF-β的ELISA試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附分析,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行,待ELISA反應(yīng)結(jié)束后立即測(cè)OD450值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各標(biāo)本OD值對(duì)應(yīng)的TGF-β濃度。1.2.4gadph擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增剖取大鼠空白組子宮內(nèi)膜和其他兩組的異位子宮內(nèi)膜,嚴(yán)格按照說明書提取總RNA,鑒定RNA完整性,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng):TGF-β上游引物序列:5′-gaatacagggctttcgcttcag-3′,下游引物序列:5′-gttggttgtagagggcaaggac-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物為399bp);GADPH上游引物序列:5′-aggttgtctcctgcgacttc-3′,下游引物序列:5′-cttgctcagtgtccttgctg-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物為210bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)半定量分析電泳條帶的吸光度,結(jié)果以目的基因與β-actin吸光度的比值表示。1.3統(tǒng)計(jì)處理所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1丹不同給藥時(shí)間對(duì)tgf-表達(dá)的影響模型組TGF-β濃度較空白組升高。治療組予丹莪婦康煎膏治療后,TGF-β濃度較模型組顯著降低。各組間TGF-β濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。2.2各組tgf-mrna表達(dá)比較模型組大鼠異位內(nèi)膜組織TGF-βmRNA的表達(dá)較空白組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。丹莪婦康煎膏治療組TGF-βmRNA表達(dá)降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。詳見表1、圖1。3體外受精血流學(xué)及免疫組化作用隨著分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)及細(xì)胞因子的消長(zhǎng)密切相關(guān)。TGF-β是一種具有多種生物功能的多肽類生長(zhǎng)抑制因子,分子量25KD,屬TGF-β超家族,是一種以抑制免疫為主的負(fù)向調(diào)節(jié)因子,它可抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的功能,誘導(dǎo)血管形成,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生、移動(dòng)和黏附;能夠促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制因子和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原的含量增高,參與盆腔粘連的形成。同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞有趨化作用,故在EMS發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Pizzo等檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥及非免疫性不孕患者腹腔液及血清中TGF-β水平時(shí)發(fā)現(xiàn),前者顯著高于后者,且隨病情加重,其水平升高。Loverro等采用免疫組化方法證明了異位內(nèi)膜中TGF-β表達(dá)顯著增加。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)證實(shí),子宮內(nèi)膜異位癥腹腔液中TGF-β的含量明顯高于正常盆腔組和盆腔粘連組。本研究結(jié)果表明,子宮內(nèi)膜異位癥大鼠TGF-β水平顯著地高于空白組,表明EMS的發(fā)病與TGF-β水平的變化關(guān)系密切。原因可能為免疫抑制作用增強(qiáng),免疫活性細(xì)胞受到抑制,由于免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)性降低造成局部免疫系統(tǒng)的功能失衡,從而導(dǎo)致異位病灶逃脫了免疫監(jiān)視,為子宮內(nèi)膜在異位處生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件,此實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β的異常表達(dá)與異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)及腹腔黏膜的黏連有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為,子宮內(nèi)膜異位癥系因瘀血阻于沖任、胞宮,胞脈氣血運(yùn)行不暢,瘀積日久,形成癥瘕,繼而導(dǎo)致不孕或痛經(jīng)。中成藥丹莪婦康煎膏用丹參活血,當(dāng)歸補(bǔ)血調(diào)血,香附理氣,莪術(shù)、三七、三棱及延胡索活血化瘀,改善盆腔血液循環(huán);甘草內(nèi)含三萜皂苷黃酮,具有補(bǔ)脾益氣、免疫調(diào)節(jié)和廣泛的激素樣作用。方中大多數(shù)藥物入肝經(jīng),具有調(diào)理氣血、活血化瘀、止痛的作用。體外研究發(fā)現(xiàn),丹莪婦康煎膏可使異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞萎縮、壞死、腺體縮小,對(duì)重要組織及臟器無不良影響及毒副作用。國(guó)內(nèi)研究亦表明,丹莪婦康膠囊能改善EMS大鼠