鐵羧葡胺-多聚賴氨酸復(fù)合物標(biāo)記豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的mr成像

鐵羧葡胺-多聚賴氨酸復(fù)合物標(biāo)記豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的mr成像

在過(guò)去10年中，移植樹(shù)干被廣泛用于缺血性心臟病、晚末期心力衰竭、糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，以及移植后干預(yù)細(xì)胞的分布、運(yùn)動(dòng)、分化和預(yù)后。傳統(tǒng)上多采用熒光染料或染色體等作為標(biāo)志物對(duì)干細(xì)胞移植進(jìn)行示蹤,但只能在離體狀態(tài)下通過(guò)組織學(xué)檢查來(lái)實(shí)現(xiàn)。近年來(lái)分子影像學(xué)和無(wú)創(chuàng)性活體示蹤技術(shù)獲得一定的發(fā)展,其中超順磁性物質(zhì)標(biāo)記干細(xì)胞后進(jìn)行MR顯像和示蹤具備空間分辨力更佳、可長(zhǎng)期示蹤等優(yōu)點(diǎn),似具有更大前景。加之近年來(lái)MR對(duì)比劑超順磁性氧化鐵顆粒(SPIO)研究取得進(jìn)展,利用SPIO作為分子探針標(biāo)記干細(xì)胞并進(jìn)行移植后的MR活體示蹤是可能的。本實(shí)驗(yàn)采用鐵羧葡胺(SHU555A,商品名Resovist)納米微粒標(biāo)記豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),在確定標(biāo)記效率和安全性的基礎(chǔ)上,探討了磁標(biāo)記干細(xì)胞的體外MR檢測(cè)閾值、MR信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞增殖的關(guān)系,并對(duì)植入心臟磁標(biāo)細(xì)胞的MR活體顯像示蹤進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1聚賴氨酸亞鐵氰化鉀緩沖液和多聚甲醛、中性紅淋巴細(xì)胞分離液(加拿大Cedarlane公司),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司),SHU555A,(德國(guó)Schering公司),多聚賴氨酸(PLL,美國(guó)Sigma公司,平均分子量275ku),亞鐵氰化鉀、中性紅(美國(guó)Sigma公司),多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS,上海鈺森生物技術(shù)有限公司)。水浴箱(德國(guó)Hettich公司),倒置相差顯微鏡(TS100,Nikon),ThermoE.IRISDuoICP發(fā)射光譜儀,MR掃描儀MagnetomAvanto1.5T(Siemens公司)。1.2細(xì)胞分離和培養(yǎng)無(wú)菌條件下豬髂后上嵴多點(diǎn)抽取骨髓液40～80ml,置于含肝素的50ml離心管中混勻,200目濾網(wǎng)過(guò)濾后,室溫2500轉(zhuǎn)/min離心5min,平頭吸管反復(fù)抽吸吹打制成單細(xì)胞懸液,將骨髓液沿壁輕輕疊加到密度1.077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液上,4℃2000轉(zhuǎn)/min梯度離心30min,吸出中間2～3mm厚的白絨層,離心洗滌,加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+雙抗含100mg/L青霉素及100mg/L鏈霉素)中充分混勻,并將分離得的細(xì)胞接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng),72h后更換培養(yǎng)液,棄掉未貼壁細(xì)胞,以后每48～72h全量換液。細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化并按照1:2比例傳代,取第3代細(xì)胞作磁標(biāo)記。1.3shu65a-pll擴(kuò)增將SHU555A和非特異性轉(zhuǎn)染劑PLL(平均分子量275ku)用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋,制成終濃度為25:0.75μg/ml的SHU555A-PLL標(biāo)記培養(yǎng)液,室溫下輕搖混合60min形成SHU555A-PLL復(fù)合物。然后用SHU555A-PLL復(fù)合物全量換液豬SMCs,置于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。1.4細(xì)胞外鐵和pelr反應(yīng)取少許標(biāo)記后0、4、8、12、16和20d細(xì)胞以及未標(biāo)記細(xì)胞沉淀,經(jīng)PBS洗滌3次(去除細(xì)胞外鐵)后,4%多聚甲醛固定15min,蒸餾水洗滌3次;Perl反應(yīng)液[2%K3(CN)6+6%HCl]中作用30min,蒸餾水洗滌3次;1%核固紅復(fù)染3min,蒸餾水洗去多余的核固紅,顯微鏡下觀察結(jié)果。1.5高氯酸-羧酸混合物傳導(dǎo)劑取標(biāo)記后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞各1×105個(gè),離心沉淀110℃干燥過(guò)夜,加入500μl高氯酸-硝酸混合物(3:1),60℃消化3h以上,以徹底破壞細(xì)胞。原子吸收分光光度儀測(cè)定鐵離子濃度,以pgFe/細(xì)胞表示。每種條件均測(cè)定3個(gè)樣品。1.6胞各細(xì)胞計(jì)數(shù)取標(biāo)記后0、4、8、12、16和20d細(xì)胞以及未標(biāo)記細(xì)胞各5μl懸液,分別與0.4%錐蟲(chóng)藍(lán)溶液5μl混合,1min后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,鏡下觀察,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞活力(錐蟲(chóng)藍(lán)拒染率)=染色陰性細(xì)胞數(shù)/100個(gè)細(xì)胞×100%。1.7鐵標(biāo)細(xì)胞檢測(cè)閾值檢測(cè)用0.25%胰蛋白酶消化后收集將未標(biāo)記細(xì)胞、不同數(shù)量標(biāo)記細(xì)胞(1×106、5×105、1×105、5×104、1×104)和標(biāo)記后培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞(標(biāo)記后培養(yǎng)4、8、12、16和20d),分別重懸于0.3%瓊脂糖0.5ml的EP管中,冷卻凝膠形成后MR成像。另外將150μl含不同細(xì)胞量(1×106、5×105、1×105、5×104、1×104、5×103、1×106未標(biāo)記細(xì)胞)的細(xì)胞沉淀注入凝膠MR成像,判斷體外鐵標(biāo)細(xì)胞檢測(cè)閾值。采用MagnetomAvanto1.5T(Siemens公司),頭線圈;視野(FOV)90cm2;激勵(lì)次數(shù)2～4;層厚2mm;矩陣256×160。成像序列:①SE序列:T1Wl,重復(fù)時(shí)間(TR)450ms,回波時(shí)間(TE)9ms。②快速自旋回波(FSE)序列:T2WI,TR4800ms,TE96ms。③梯度回波序列(GRE):WI,TR800ms,TE26ms。分別測(cè)量感興趣區(qū)信號(hào)強(qiáng)度(SI),信號(hào)強(qiáng)度改變以下列公式計(jì)算:ΔSI=[(SI標(biāo)-SI未標(biāo))/SI未標(biāo)]×100%(ΔSI為信號(hào)變化率,SI標(biāo)為標(biāo)記細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度,SI未標(biāo)為未標(biāo)記細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度)。圖像由2名獨(dú)立的MR專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行分析判斷。1.8體部相控陣4g-lg-ga結(jié)扎前降支建立豬急性心肌梗死模型(n=1,圖1),2周后開(kāi)胸直視下經(jīng)心外膜向左室梗死交界區(qū)(梗死區(qū)呈紫黑色)和正常心肌內(nèi)緩慢注射1×106細(xì)胞,每點(diǎn)150μl,共4點(diǎn)。其中2點(diǎn)為磁標(biāo)記細(xì)胞,2點(diǎn)為未標(biāo)記細(xì)胞。輕壓注射點(diǎn)片刻關(guān)胸。移植后1周進(jìn)行體部相控陣線圈心電門控下GRE序列WIMR成像,矩陣256×125,層厚4mm,TR122ms,TE12.1ms。顯像后處死動(dòng)物,低信號(hào)區(qū)心肌組織普魯士藍(lán)染色。1.9統(tǒng)計(jì)分析所有計(jì)量數(shù)據(jù)以表示,組間比較應(yīng)用SPSS11.5軟件ANOVA方差分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義2結(jié)果2.1梭形細(xì)胞傳代骨髓液接種24h即有少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈卵圓形或細(xì)小梭形,72h后貼壁細(xì)胞伸展,7d后出現(xiàn)較大的克隆,為形態(tài)均一的梭形細(xì)胞,大約經(jīng)10～14d達(dá)80%～90%融合。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)呈漩渦樣,平均每3～5d左右即可傳代。取第3代細(xì)胞作鐵標(biāo)記(圖2)。2.2細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量如圖3～4所示,SHU555A-PLL標(biāo)記的MSC經(jīng)普魯士藍(lán)染色后在光鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量著藍(lán)色顆粒,標(biāo)記率為100%,細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量平均為(13.13±2.30)pg/細(xì)胞。隨細(xì)胞的分裂增殖,細(xì)胞內(nèi)藍(lán)染顆粒逐漸減少,鐵離子含量逐漸減少,到16d時(shí)細(xì)胞內(nèi)殘存少許鐵顆粒,鐵離子含量下降到(0.68±0.20)pg/細(xì)胞,20d時(shí)(0.28±0.07)pg/細(xì)胞,接近標(biāo)記細(xì)胞水平(0.21±0.06pg/細(xì)胞,P均>0.05)。而未標(biāo)記的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)著色顆粒。2.3標(biāo)簽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響各時(shí)間點(diǎn)磁標(biāo)記細(xì)胞的錐蟲(chóng)藍(lán)拒染率在91%～94%之間,與相應(yīng)的未標(biāo)記細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖5)。2.4磁共振成像對(duì)細(xì)胞的外部成像2.4.1i和t1wi信號(hào)改變3種序列成像所顯示的信號(hào)改變見(jiàn)圖6。相比T2WI和T1WI,GREWI信號(hào)改變最為明顯,成像細(xì)胞數(shù)量越多,信號(hào)改變?cè)矫黠@。同時(shí)WI的磁敏感效應(yīng)也使相應(yīng)圖像放大失真,氣體交界區(qū)大量偽像出現(xiàn)。2.4.2wi靈敏度檢測(cè)3個(gè)序列中,WI的信號(hào)強(qiáng)度改變率最大,T2WI次之,T1WI最小。如5×104磁標(biāo)細(xì)胞信號(hào)在T1WI和T2WI的ΔSI分別為(5.04±4.11)和(-4.43±13.40),與未標(biāo)記比較均未見(jiàn)明顯改變,但WI已有明顯下降(ΔSI=12.18±3.51,P<0.05),說(shuō)明WI檢測(cè)順磁信號(hào)的靈敏度高。另外,ΔSI隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而增大,兩者呈正相關(guān)。2.4.3wi信號(hào)消失后,wi磁標(biāo)低信號(hào)開(kāi)始消失,但w在培養(yǎng)不同時(shí)間,均采用1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行MR成像,發(fā)現(xiàn)隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),WI磁標(biāo)低信號(hào)逐漸消失。進(jìn)一步量化分析顯示(圖7),3不同序列MR信號(hào)強(qiáng)度改變率均演變趨向?yàn)?,3種序列中以WI信號(hào)改變幅度最為明顯,12d以后信號(hào)強(qiáng)度和未標(biāo)記細(xì)胞對(duì)照組接近,這與前述的細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的下降演變相一致。2.4.4使用1.5tmr成像儀此儀器最少能檢測(cè)到5×104～1×105個(gè)SHU555A-PLL標(biāo)記的MSC(圖8)。2.5sc與周圍心肌的低信號(hào)區(qū)心肌梗死豬細(xì)胞移植后1周行WI成像,左室壁注射磁標(biāo)MSC的2個(gè)部位均呈明顯的低信號(hào)區(qū),與周圍心肌構(gòu)成明顯對(duì)比(圖9),而非標(biāo)記細(xì)胞的2個(gè)注射點(diǎn)均未顯示低信號(hào)。動(dòng)物處死后低信號(hào)區(qū)病理切片見(jiàn)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞。3討論3.1標(biāo)記效率與mr細(xì)胞閾值檢測(cè)干細(xì)胞移植后無(wú)創(chuàng)性活體示蹤能有效地解決目前干細(xì)胞治療中許多困惑和爭(zhēng)議,已成為目前研究的熱點(diǎn)。其中,MR對(duì)比劑標(biāo)記后MR成像受到了國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)科的重視。應(yīng)用最為普遍的磁標(biāo)記方案是菲立磁(Ferumoxides,商品名Feridex,直徑為50nm)和高分子量PLL組合。PLL作為一種非特異性轉(zhuǎn)染劑,包裹SPIO后通過(guò)靜電作用能有效介導(dǎo)氧化鐵微粒進(jìn)入細(xì)胞,能使細(xì)胞對(duì)鐵的攝取增加2.6倍。本課題使用的SHU555A顆粒直徑62nm,大于菲立磁,更有利于細(xì)胞攝取。我們對(duì)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鐵離子進(jìn)行定量,發(fā)現(xiàn)以25:0.75μg/lSHU555A-PLL24h方案標(biāo)記豬MSC,能使細(xì)胞內(nèi)平均鐵離子濃度達(dá)到(13.13±2.30)pg/細(xì)胞,與25:3μg/m菲立磁-硫酸魚(yú)精蛋白24h標(biāo)記方案、25:0.75μg/m菲立磁-PLL24h標(biāo)記方案的標(biāo)記效率相接近。證明SHU555A-PLL同樣能高效標(biāo)記MSCs。為觀察細(xì)胞遷移的具體情況,或觀察經(jīng)血管注射的細(xì)胞分布,探測(cè)極少量的細(xì)胞顯得尤為重要。細(xì)胞標(biāo)記效率的高低直接決定MR能檢測(cè)的最少細(xì)胞量,標(biāo)記效率的不同導(dǎo)致相同磁場(chǎng)強(qiáng)度下細(xì)胞探測(cè)閾值的不同。Daldrup-Link等用AMI-227(Ferumoxtran)、菲立磁、P7228脂質(zhì)體轉(zhuǎn)鐵蛋白-磁性多醣納米顆粒標(biāo)記造血前體細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)含鐵量分別為(0.11±0.04)、(0.24±0.07)、(0.18±0.05)、(0.98±0.24)μg/105細(xì)胞,較低鐵標(biāo)記效率導(dǎo)致1.5TMR儀探測(cè)閾值偏低,分別為5×105、2.5×105、2.5×105和1×105個(gè)細(xì)胞。而Matuszewski等報(bào)道1.0mg/mlSHU555A-脂質(zhì)體24h標(biāo)記方案標(biāo)記人肺癌腫瘤細(xì)胞(CLL-185),細(xì)胞內(nèi)鐵高達(dá)(4.37±0.08)μg/105細(xì)胞,1.5TMR儀能檢測(cè)到1×104細(xì)胞;本研究采用25:0.75μg/mlSHU555A-PLL24h標(biāo)記方案,細(xì)胞內(nèi)鐵(1.31±0.23)μg/105細(xì)胞,1.5TMR檢測(cè)到5×104～1×105個(gè)豬MSC。上述3組研究標(biāo)記效率、MR細(xì)胞閾值的差異,一方面源于鐵劑種類大小和包被、標(biāo)記時(shí)間和轉(zhuǎn)染劑使用的不同,除此之外,可能與細(xì)胞種類和吞噬活力不同也密切相關(guān)。影響MR檢測(cè)閾值的另一決定性因素是MR儀磁場(chǎng)強(qiáng)度和空間分辨率。最近已有體外MR單細(xì)胞成像的報(bào)道,如Stroh等用17.6TMR儀檢測(cè)SPIO納米顆粒標(biāo)記大鼠胚胎干細(xì)胞[細(xì)胞內(nèi)鐵為(7.1±0.4μg/105細(xì)胞)],體外凝膠成像探測(cè)閾值為10個(gè)細(xì)胞,定向注射到大鼠紋狀體的探測(cè)極限為10～100個(gè)標(biāo)記細(xì)胞,顯示了超強(qiáng)磁場(chǎng)強(qiáng)度MR儀示蹤干細(xì)胞的巨大價(jià)值。但現(xiàn)有MR成像儀磁場(chǎng)強(qiáng)度和成像條件下,增加干細(xì)胞鐵標(biāo)記效率是提高檢測(cè)靈敏度的有效途徑,而本研究采用的SHU555A-PLL方案值得推薦采用。3.2mr信號(hào)改變與鐵含量、細(xì)胞數(shù)目的關(guān)系對(duì)于氧化鐵納米顆粒來(lái)說(shuō),效應(yīng)比R2效應(yīng)強(qiáng)得多,而且磁敏感效應(yīng)使信號(hào)改變的體積大大超過(guò)細(xì)胞本身所占據(jù)的實(shí)際大小,這就增加了標(biāo)記細(xì)胞在MR上的發(fā)現(xiàn)率。我們以3種序列行標(biāo)記干細(xì)胞MR成像,證實(shí)GREWI序列對(duì)磁標(biāo)記干細(xì)胞的顯示最為敏感,5×104個(gè)細(xì)胞即可引起明顯的信號(hào)改變。并且隨著細(xì)胞數(shù)目的增加,3種序列的信號(hào)改變均呈劑量依賴型增加,尤其是WI信號(hào)改變幅度最大,與國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究一致,說(shuō)明MR信號(hào)改變與鐵含量、細(xì)胞數(shù)目之間存在一定關(guān)系。但由于WI磁敏感效應(yīng)也使相應(yīng)圖像放大失真,氣體組織交界面磁敏感偽影很大,在一定程度上干擾了信號(hào)噪聲比(SNR)和信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)量,所以是否可根據(jù)MR信號(hào)強(qiáng)度的改變來(lái)推測(cè)鐵含量乃至細(xì)胞數(shù)目,尚需進(jìn)一步探討。國(guó)內(nèi)外也有學(xué)者試圖通過(guò)測(cè)量R2*值、低信號(hào)區(qū)直徑或容積估計(jì)細(xì)胞內(nèi)鐵濃度和細(xì)胞數(shù)量:發(fā)現(xiàn)R2*值和細(xì)胞內(nèi)鐵濃度存在線性相關(guān);信號(hào)缺失直徑明顯受到回波時(shí)間和空間分辨率的影響,信號(hào)缺失直徑是局部鐵離子濃度的對(duì)數(shù)函數(shù);低信號(hào)區(qū)面積和注射的細(xì)胞量呈線性相關(guān)。但該領(lǐng)域研究尚處于初級(jí)階段,上述參數(shù)的測(cè)量評(píng)定會(huì)受儀器磁場(chǎng)強(qiáng)度和分辨率、氣體交界面以及體內(nèi)呼吸運(yùn)動(dòng)、腸蠕動(dòng)等諸多因素的影響,加上體外干細(xì)胞如MSC攝取氧化鐵顆粒不均一性、SPIO標(biāo)記后細(xì)胞內(nèi)鐵會(huì)隨著細(xì)胞的分裂、死亡而變化,所以體內(nèi)外移植細(xì)胞的定量仍然存在很多問(wèn)題。3.3mtt細(xì)胞間質(zhì)控制率和細(xì)胞增殖速度的變化Arbab等報(bào)道分裂型Hela細(xì)胞菲立磁標(biāo)記后經(jīng)2～3周細(xì)胞內(nèi)普魯士藍(lán)染顆粒消失,而非分裂型(長(zhǎng)滿后接觸抑制)人MSCs細(xì)胞鐵顆粒存留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)43d以上。本研究發(fā)現(xiàn),隨著MSCs的不斷分裂繁殖和細(xì)胞內(nèi)鐵逐漸減少,MR信號(hào)降低的幅度也相應(yīng)減少,第16～20d已基本達(dá)到未標(biāo)記細(xì)胞水平。所以不難推論,細(xì)胞內(nèi)鐵的衰減速度與細(xì)胞的不同分裂增殖狀態(tài)之間存在相當(dāng)關(guān)系,MR信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的下降主要原因是細(xì)胞分裂稀釋。但能否根據(jù)植入體內(nèi)細(xì)胞的信號(hào)衰減情況來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)記細(xì)胞增殖分裂速度,尚不得而知,因?yàn)殡y以排除代謝清除和細(xì)胞死亡的干擾。如有可能利用MR信號(hào)強(qiáng)度和范圍的改變間接判斷